大鼠传代培养肝细胞的形态学观察.docVIP

　　大鼠传代培养肝细胞的形态学观察 【关键词】肝/细胞学 关键词:肝/细胞学;连续传代培养;显微镜检查，电子;大鼠 摘要:目的将大鼠肝细胞进行传代培养，并观察其形态学特点.方法采用胶原酶二步法灌注1mo龄SD雄性大鼠肝脏，制备肝细胞悬液并进行原代及传代培养，对其形态学进行了观察.结果肝细胞已传7代，每次传代培养6d左右，光镜下可见大量新生肝细胞生长，呈多边形，相嵌紧密排列.电镜下可见核变形，有的为双核细胞.此外，胞质内的糖原颗粒也逐渐减少.结论成功进行了肝细胞的传代培养，为肝细胞的研究提供了一种方便的研究方法. 　　Keyicroscopy，elec-tron;rats 　　Abstract:AIMTosubculturerathepatocytesandtoob-servetheirmorphologicalcharacteristics.METHODSHepa-tocytes1-month-oldratsbytaryculture-sofhepatocytesorphologicalcharacteristicsicroscope，andagreatnumberofneoformativepolygonhepatocytesedeformedunderTEM.Someofthemdecreased.CONCLUSIONSubculturerathepatocytesprovideaconve-nientmethodforthestudyofhepatocytes. 　　0引言 　　在研究体外肝脏多种多样的功能中，需要建立一个简单的系统来精确地模仿体内肝脏的活动.1969年Berry和Friend用胶原酶灌注分离细胞，使细胞产量大幅度提高，这些细胞具有许多肝脏功能.我们在肝细胞原代培养的基础上，又成功地进行了肝细胞的传代培养，以利于肝细胞的研究. 　　1材料和方法 　　1.1材料上海产1mo龄SD雄性大鼠，体质量90～100g.DMEM培养基（Gibco公司），0.3g#12539;L-1Ⅰ型胶原酶溶液5.0mL（Sigma公司，DMEM为溶剂），磷酸缓冲液（PBS）250mL，RDB-TB蠕动泵（江苏省张家港市仪表仪器总厂），离心机，型号为Biofuge15R（德国Heraeus公司）. 　　1.2方法SD雄性大鼠腹部消毒后按2mL#12539;kg-1，ip，10g#12539;L-1戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定.脱去胸腹部毛，消毒，无菌操作下，开胸将导管插入下腔静脉胸段，丝线固定.开腹显露门静脉，远离肝脏处结扎肝动脉、脾静脉、下腔静脉与肾静脉汇合处，剪破门静脉近肝脏处，以9mL#12539;min-1速度灌注PBS15min，以8mL#12539;min-1速度灌注Ⅰ型胶原酶溶液10min，收集细胞于DMEM中，依次经100，150，180，280，400目不锈钢滤网过滤后的细胞悬液于4℃，50g离心2min，弃上清，反复离心3次，沉积的细胞用含100mL#12539;L-1小牛血清DMEM调整细胞密度为2×108#12539;L -1，台盼蓝拒染法测细胞活力0.90，以此细胞密度在6孔培养板中加入细胞4×105/孔.36h后首次换液，以后每48h换液1次.肝细胞培养20d时，于位相差倒置显微镜下可见细胞融合成片.传代前用无血清培养基培养1d，弃去培养液，加入1.25mL#12539;L-1胰蛋白酶（1mL/孔）于37℃作用6min，镜下见胞质回缩，细胞间隙增大.此时吸去胰蛋白酶加入含100mL#12539;L-1小牛血清DMEM，吸管轻轻反复吹打培养皿底部，调整细胞密度为2×108#12539;L-1.台盼蓝拒染法测细胞活力为0.98，重新接种于新的培养皿进行传代.在位相差显微镜下观察培养6d的各代肝细胞形态并拍照.经首次传代培养6d的肝细胞，吸出培养液，加入1.25mL#12539;L-1胰蛋白酶于37℃下作用8min，吸去胰蛋白酶，加入含100mL#12539;L-1小牛血清DMEM，吸管轻轻吹打培养皿底部，细胞悬液收集于锥形离心管中，以2000r#12539;min-1速度离心10min，沉积物加入戊二醛固定，常规包埋，切片，染色，于透射电镜下观察并摄像.细胞计数与活力检测:细胞培养过程中用台盼兰拒染法检测培养细胞活力，用血球技术板计算细胞数. 　　2结果 　　肝细胞传代培养6d，可见新生肝细胞大量生长，呈多边形，相嵌紧密排列.细胞培养过程中未见成纤维细胞生长，亦无细菌及真菌污染.培养中抽查细胞活力为0.98，现已传7代（Fig1）.传一代肝细胞在电镜下可见核变形，有的为双核，细胞膜上有大量微绒毛（Fig2）.胞质内有丰富的细胞器，如大量的内质网和线粒体