大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响 .docVIP

　　大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响 ：寇晨光 曹成波 燕晓雯 罗兵 周岩冰 【摘要】 目的 观察大鼠肝实质细胞与Kupffer细胞体外共同培养时对两者生长、形态及功能的影响。方法采用原位二步Ⅳ型胶原灌注法、Percoll液密度梯度离心法分离 of the cells under different circumstances easured by radioimmunoassay at 36 hours. Results In solitary?culture group, the hepatocytes gre of normal liver cells, en in supernate of co?culture group, at 24 h, 36 h, 48 h and 60 h, e time points as above, aintained for empirical study. 　　[KEY ins; cytokines; rats 　　肝细胞分离、培养是研究肝脏和肝细胞的良好方法。尽管肝细胞在体内拥有相当强的增殖能力，但要肝细胞在体外保持分化状态且能继续增殖却非常困难。要明确影响肝细胞生长、分化和死亡的因素等，仍然面临认识水平和技术的挑战。实验已证实，肝实质细胞与非肝实质细胞或非肝细胞的共同培养可有效延长肝细胞的生存时间，促进肝细胞增殖;有助于保持细胞间特有的胆管结构，促进形成缝隙连接;可促进肝细胞的合成和分泌功能;有助于肝细胞维持其解毒功能[1?4]。目前进行的共同培养主要有肝细胞?非肝细胞培养或肝实质细胞?非实质细胞培养，而对肝细胞与Kupffer细胞的共同培养的报道还较少。本实验在体外将肝实质细胞与Kupffer细胞共同培养，观察体外联合培养体系中肝细胞形态、生长情况、功能的变化以及Kupffer细胞细胞因子分泌情况,旨在为肝细胞在病毒学、免疫学、药理学及肝细胞移植等方面的研究提供良好的平台。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　雄性I?1640完全培养基购于中国医学科学院生物医学工程研究所;Ⅳ型胶原酶、2.5 g/L胰酶、锥虫蓝均购于美国Sigma公司;Percoll液购自于北京华美公司;考马斯亮蓝G?250、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒均由杭州博日生物技术有限公司提供;125I肿瘤坏死因子?α(TNF?α)放射免疫分析试剂盒、125I白细胞介素1(IL?1)放射免疫分析试剂盒、125I白细胞介素?6(IL?6)放射免疫分析试剂盒均购自北京普尔伟业生物科技有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 肝细胞及Kupffer细胞的分离 本文参照SMEDSROD等[5]方法加以改良分离收集肝细胞，利用Percoll液密度梯度离心法收集Kupffer细胞。 　　1.2.2 肝细胞和Kupffer细胞的培养及观察 单独培养组调整肝细胞密度至1.5×108/L并接种到培养皿，置于含体积分数0.05 CO2孵箱，在37 ℃、100%湿度条件下培养，12 h后更换新鲜培养液。共同培养组将肝细胞按1.5×108/L的细胞密度、Kupffer细胞按2.5×107/L细胞密度(6∶1) 共同接种于培养皿，置于含体积分数0.05 CO2孵箱，在37 ℃、100%湿度条件下培养，12 h后更换新鲜培养液。每培养12 h更换培养液并吸取上清液用全自动生化检测仪检测清蛋白、ALT、AST、IL?1、IL?6、TNF?α，并观察细胞形态及生长情况。 　　1.2.3 检测指标 采用考马斯亮蓝G?250方法测定清蛋白，采用ELISA法分别检测上清液中ALT、AST、IL?1、IL?6及TNF?α含量。 　　1.3 统计学处理 　　采用PPMS 1.5软件[6]进行统计学处理，数据以±s表示，组间比较用两样本均数t检验。 　　2 结 果 　　2.1 形态学观察 　　倒置显微镜下，新分离的大鼠肝细胞晶莹透亮，呈圆球形，折光性强，有立体感。台盼蓝染色计数显示健康肝细胞的比例平均为92%。同时，新分离的Kupffer细胞胞浆透亮，多呈圆球形，少数呈多形性，散在分布，大小不一致，约6 h后，细胞开始伸展，体积增大，48 h后细胞充分展开，呈典型的星形或多边形，边界不清。在单独培养组，肝细胞的生长、增殖较共同培养组的细胞迅速，接种4 h后肝细胞贴壁、伸展，连接成条索状;24 h后绝大多数肝细胞贴壁，呈扁平状，体积明显增大;48 h后肝细胞贴壁牢固，细胞开始增殖，细胞间出现岛状连接，部分肝细胞呈双核;72 h后肝细胞开始增殖，在原来肝细胞周围出现透明且体积较小的上皮样细胞，呈多边形，逐渐铺满培养皿底;10 d后培养液的上清中悬浮细胞逐渐增多，细胞开始大量死亡;至培养15 d时