人血清蛋白质组中小分子量蛋白质多肽的分离与检测.PDFVIP

西北大学学报( 自然科学网络版) 2007 年 1 月，第 5 卷，第 1 期 Science Journal of Northwest University Online Jan,2007, Vol.5 ,No. 1 人血清蛋白质组中小分子量蛋白质/多肽的 分离与检测 1 1 1 1 2 1 王斌强 ，白 泉 , 吴 磊 ，陈 刚 ，贺 林 ，耿信笃 (1 西北大学 现代分离科学研究所/现代分离科学陕西省重点实验室，陕西 西安，710069 ；2 陕西省肿瘤医院 检验科， 陕西 西安，710061) 摘要 为建立色谱法和质谱结合对人血清中小分子量蛋白质进行分离与检测的方法。用体积排阻 色谱对变性后血清中的蛋白按其分子量的大小进行分离富集，经过反相色谱进一步分离后，并用 基质辅助激光解吸附/ 电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在未酶解的情况下直接检测这些蛋白， 在人血清中共检出 300 余种低分子量蛋白/ 多肽(15 kDa 以下)；通过对血清变性前后质谱变化比较， 得到了 80 余种与高丰度蛋白结合的小分子量蛋白/肽。将此方法应用于胃癌血清蛋白质组学研究 中取得了很好的效果，因此本方法可以用于肿瘤标记物(biomarker)的筛选。 关键词 蛋白质组学；液相色谱；激光解吸附/ 电离飞行时间质谱；血清 中图分类号：O652.63 文献标识码：A 文章编号：1000-274X(2006)0257-006 蛋白质组学及其在肿瘤研究中的应用是目前生命科学中的热点研究领域[1-3] 。人血清中蛋白质数量极 大，是非常理想的生物样本[4]，但由于血清中高丰度和低丰度蛋白的含量相差10个数量级，且许多低丰度 的小分子量蛋白/ 多肽是和高丰度蛋白（如白蛋白、免疫球蛋白等）结合在一起的，很难检测[5]，而这些低 丰度的小分子量蛋白往往对人体起着非常重要的作用。例如：P. A. E. Matthlas等人[6]用SELDI-TOF MS在人 血清中检测出3种蛋白，可以将不同的胃癌正确分类，其中两种蛋白分子量在5 000 Da 以下。E.F.Petricoin 等人[7]在人血清中发现了5种分子量在2 500 Da 以下的蛋白，可正确区分卵巢的肿瘤和非肿瘤疾病。 为了更准确、灵敏地检测这些低丰度的小分子量蛋白，消除高丰度蛋白对低丰度蛋白的影响，目前通 常是用基于抗原抗体相互作用的亲和填料除去白蛋白和免疫球蛋白[8] 以及用膜过滤的办法除去大蛋白。例 如，S.Radhakrishna 等[5]采用 20% 的乙腈稀释血清以减小血清中蛋白质与蛋白质/ 多肽之间的相互作用力， 用超滤的方法除去大分子量蛋白质，并用 LC-MS/MS 在人血清中成功鉴定出 340 多种小分子量蛋白质。但 是，这些亲和填料价格较高，很难重复利用，而且这两种方法都存在低丰度蛋白损失的现象。 本文用 5 mol/L 脲对人血清进行稀释和变性，以消除血清中蛋白质-蛋白质/ 多肽之间的相互作用力，然 后用体积排阻色谱(SEC)对变性后血清中的蛋白按其分子量的大小进行分离并富集，得到了分子量较小但 种类较多的低丰度蛋白，从而消除了高丰度大分子量蛋白质对小分子量蛋白/ 多肽的影响。经过反相色谱 (RPLC)进一步分离后，并用基质辅助激光解吸附/ 电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在未酶解的情况下直 接分析检测这些蛋白。在人血清中共检出 300 余种低分子量蛋白/ 多肽(15 kDa 以下)，同时通过比较变性前 后这些蛋白/ 多肽种类及丰度的变化，得到了 80 余种与白蛋白相结合的小分子量蛋白。 ________________________ 收稿日期：2006-05-19 审 稿 人：郑建斌，西北大学教授,博士生导师。 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 1.1.1 仪 器 高效液相色谱仪（LC-10A ，日本岛津公司），包括紫外可见检测器、二极管阵列检测器、 Class-VP 色谱工作站；实验所用超纯水由 Barnstead E-Pure 纯水器制备；真空