第十一章_电泳技术(上课用).ppt

第十一章 电泳技术 第十一章 电泳技术第一节 概 述 电泳的定义: 电泳就是在电场作用下各种胶体颗粒的迁移.具有不同电荷密度的生物大分子将以不同的速度迁移,从而得以分离.目前广泛使用凝胶支持介质进行电泳. 常规电泳分离技术 电泳分离的基本原理 1.1 电泳基本原理： 带电粒子的迁移--小分子，生物大分子，蛋白质，核酸，病毒 颗粒，细胞器等。不同等电点的AA在电解质中所带的电荷不 一样。pHpI时，蛋白质分子释放出H+，而使蛋白壳带负电， 向正极方向移动。当pHpI时，其结果相反。 1.2 凝胶电泳模型 A=?C 1.3 泳动度： 泳动速度用迁移率或泳动度表示。泳动度的定义： 带电的颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 泳动度与被分离的组成的球形分子大小，介质粘度， 颗粒所带的电荷有关。在一定的条件下，任何带电颗粒 都具有特定的泳动度，它是胶体颗粒的一个物理常数 -蛋白质和核酸。 电渗现象 电渗方向与样品方向一致，加快样品移动。反之相反。 颗粒泳动的表面速度与由颗粒泳动速度+电渗携带颗粒的移动速度。（V1+V2) 5 对支持物的选择：支持物均匀，吸附力小，否则 电电场不均匀，影响区带的分离。实验结果及扫描图 谱均无法重复。 纸电泳所用的滤纸不均匀或吸附力过大，蛋白质 在电泳过程中一部分会被滤纸所吸附，适合分离区带 蛋白质含量相对量降低。 6 温度对电泳影响: 热对电泳影响较大；温度升高，介质粘度下降， 分子运动加剧，引起自由扩散变快，迁移率增加，分 离度降低。控制电压或电流，加强冷却装置。 7 筛孔： 筛孔大的颗粒，溶质颗粒泳动度增大，反之，则 泳动速度慢。 Q=I2RT 第十一章 电泳技术第一节 概 述 经常使用的电泳: 1.天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 2.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE) 3.等电聚焦（IEF） 4.双向电泳 5.免疫电泳(IE) 6.蛋白质电泳 7.毛细管电泳(CE) 电泳技术的分类 1.按分离原理分类： 区带电泳：独立区带 移界电泳：自由界面电泳分离效果差 等速电泳：当电泳达到平衡时，各区带随分 离清晰的界面，并以等速原理移动。 等电聚焦电泳--两性电解质载体形成pH梯度， 按等电点分离。特点：聚成很窄的区带且分辨率 很高。 　　　　　　　　 2.按有无固体支持物分类： 　（１）自由电泳：　显微电泳（细胞电泳）：细菌 的电泳行为，移界电泳，柱电泳（密度梯度），自由 流动幕电泳，等速电泳。 　（２）支持电泳：无阻滞支持电泳：滤纸电泳，醋 酸纤维薄膜电泳，纤维素粉，淀粉，玻璃粉，聚丙烯 酰胺粉末。 高密度的凝胶：淀粉凝胶，聚丙烯酰胺，琼脂糖电泳或琼脂糖凝胶 3. 醋酸纤维素薄膜电泳 　　　对蛋白质吸附样品极少，无拖尾现象。 第十一章 电泳技术第一节 概 述 凝胶电泳是一种杰出的分析手段.通过电泳能获得样品组分信息,能帮助估计样品的分子量和等电点及其分布. 蛋白质分子量的测定主要采用SDS－PAGE,等电点的测定可使用等电聚焦.双向电泳是目前最有效的分析复杂蛋白质混合物的方法之一. 第十一章 电泳技术第一节 概 述 电泳优点: 操作简单, 设备便宜, 分辨率高, 易于多个样品分析, 灵敏度高, 易于特异检测, 能给出结合图谱. 第十一章 电泳技术第一节 概 述 一.基本原理 (一) 蛋白质的电荷来源 电泳分离的基础是建立在蛋白质是带电颗粒.蛋白质的电荷来自于氨基酸的离子化侧链基团,包括酸性残基、碱性残基、 氨酸残基以及荷电的非蛋白质组分如脂类或碳水化合物. 不同蛋白质分子由于氨基酸组成不同,所带电荷的电性和电量也不同,由此可进行蛋白质的分离和分析. 第十一章 电泳技术第一节 概 述 (二) 电泳的迁移率 在一定pH条件下,蛋白质分子会解离而带电,不同的带电颗粒在同一电场的运动速度不同,可用迁移率来表示: 迁移率即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度(m). m=Q/6πrη 迁移率与球形分子的半径、介质黏度 、颗粒所带电荷有关.一般来说,所带静电荷越多,颗粒越小,越接近球形,则在电场中迁移速度越快,反之越慢. 第十一章 电泳技术第一节 概 述 (三) 电渗 电渗就是流动相对于固体支持介质的移动. 电渗流的强度取决于凝胶的电荷密度、电压和缓冲液浓度. 为消除电渗现象可选择无电渗的电泳介质.但免疫电泳,保持—控制的电渗流是有益的. 第十一章 电泳技术第一节 概 述 (四) 影响电泳效果的因素