第四章 细胞破碎技术.ppt

第四章 细胞破碎技术 细胞： 细菌 酵母 霉菌 动物细胞 植物细胞 一、细胞壁的结构 1. 细菌细胞壁结构： G+: 肽聚糖 G-: 外壁层为脂多糖和磷脂、脂蛋白；内壁层肽聚糖。 （脂多糖需Ca2+、Mg2+才能稳定） 2. 酵母：由酵母纤维素组成，主要成分是葡聚糖和甘露聚糖 3. 霉菌：几丁质和葡聚糖 4. 植物细胞：纤维素、半纤维素、果胶、木质素等 5. 动物细胞：无细胞壁 二、常用细胞破碎方法 1.实验室方法(小规模)： 旋刀匀浆法图 通过固体剪切力进行破碎，剧烈 能完全破坏动、植物细胞，但酵母、细菌细胞不同 注意防止升温 研磨法图 利用磨料与细胞间的剪切及碰撞作用，温和，常在研钵内进行（或细胞匀浆器） 常用磨料：石英砂、氧化铝 增效方法：预先冷冻样液 旋刀匀浆器 研磨法仪器 X挤压法（改进的高压匀浆法） 浓缩的菌体悬浮液冷却至-30 ℃ ~-25 ℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击 适用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低、活性保留率高 主要用于实验室 对冷冻－融解敏感的生物物质不适合 3. 超声波破碎法（ultrasound） 超声波振荡器，15-25kHz的超声波 超声设备：槽式，探头式 图 超声波作用机理：空化作用 破碎作用影响因素：超声波的声强、频率、处理时间、液体的温度等 优点：操作简单，液量损失少。 缺点：易失活，噪声，大容量时声能不易传递、不易散热。 常用间歇处理，冰浴冷却。多在实验室规模用。 反复冻融法 将细胞在-15℃下急剧冻结、室温缓融，反复多次 机理：冷冻促进细胞膜疏水键结构破裂，增强其亲水性能；胞内水形成冰晶粒胀破细胞 缺点：溶质释放、扩散慢 渗透压破碎法（溶胀法） 机理：低渗溶液细胞溶胀，也称渗透压冲击法 操作：一定体积的浓细胞液，加入2倍体积的水中 操作方法改进：细胞预先置于高渗介质中 特点：最温和，用于易破碎的细胞，如动物细胞、G-等 通过化学试剂使细胞壁和细胞膜结构改变或破坏。常用有：酸、碱、表面活性剂、有机溶剂等类别。 细菌：溶菌酶，G- 还需加入EDTA 酵母：消解酶、β-葡聚糖酶、甘露糖酶、蜗牛酶 霉菌：几丁质酶、蜗牛酶 植物：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 自溶法：细胞内酶（调节温度、pH或添加有机溶剂诱导细胞自溶）。 细胞破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数。即： Y=(N0-N)/N0×100% N0—原始细胞的数量 N—经细胞破碎处理后余下的完整细胞数 应从以下方面考虑： 细胞的处理量 细胞壁的结构、强度 目标产物对破碎条件的敏感性 破碎程度 具体的操作条件应从以下三方面进行权衡： 高的产物释放率 低的能耗 便于后续提取 实际应用中，常采用多种方法结合： 主要为机械法与非机械法的结合，如 酶+高压匀浆 酶+超声 其他如：化学法+冻融法 五、基因工程包含体的纯化方法 包含体：外源基因在细胞内高度表达蛋白，因此凝集而成的无活性固体颗粒。 包含体为致密凝聚体，密度较大，低速离心便可沉淀，与细胞碎片和可溶性产物分离。 * * 生物分离的目的组分： 胞内产物 胞外产物 细胞破碎的难易： 与细胞种类有关 与目的物的稳定性有关 （一）机械破碎法 研钵 细胞匀浆器 高压匀浆法 2.大规模方法： 过程：高压(可达50-100Mpa)喷出—碰撞—释放到低压 高压造成升温2-3℃/10MPa，需注意冷却料液 影响因素：压力、循环次数、温度 适用于酵母和绝大多数细菌，不适于团状、丝状菌 处理能力可达0.1-100 m3/h 高速珠磨法（beadmill） 利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌 提高破碎效率的方法：提高搅拌速度、增加小珠量、降低细胞浓度、降低通过珠磨机的循环速率 高速珠磨机 超声设备 探头式 （超声细胞破碎仪） 槽式 （超声清洗仪） （二）物理破碎法 物理法总体不适于大规模生产，因破碎率低、效果较差 （三）化学破碎法 表面活性剂、碱——溶解细胞壁上的脂质或使细胞内组分渗漏。表面活性剂如胆酸盐、SDS、Triton X-100、Tween等。 酸——蛋白质水解成氨基酸，常用6M HCl。 有机溶剂——可溶解磷脂层，使细胞结构破坏。如丁酯、丁醇、丙酮、氯仿、甲苯等。 优点：产物释出性好、细胞外形完整、碎片少、胞内杂质释放少，便于后步分离 缺点：易引起目的物失活，可能给后续产物纯化带来困难，从而影响最终纯度 （四）酶法破碎法 应用酶破坏细胞壁，可部分或完全破坏细胞壁，再结合其他方法破坏细胞壁。 酶法优点：条件温和、反应迅速、选择性强； 缺点：价格贵、通用性差、有时存在产物抑制、难适用于大规模工业操作，受影响因素多 三、细胞破碎率的评价 细胞数的计算方法： 直接计数法：血球计数板 间接计数法：细胞破碎后，测定