第九章 分子定向进化.pptVIP

第八章 分子定向进化育种 一、酶定向进化发展历史 定向进化是近20年发展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。 二、理性设计 寡核苷酸引物介导的定点突变 PCR介导的定点突变 盒式突变 点饱和突变技术是通过对目的蛋白的编码基因进行改造,短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。它不是定点突变技术的简单延伸,而是蛋白质设计理念的全面升华,广泛地应用于蛋白质改造及结构—功能关系研究中,并取得了一系列令人瞩目的成绩。如利用点饱和突变技术鉴定蛋白质功能位点,提高酶比活力,改善酶热稳定性、底物结合特异性及立体异构特异性等多方面性质。 1、寡核苷酸定向诱变 该方法于上世纪70年代末建立,将目的基因克隆到噬菌体M13单链表达载体上,然后合成一段在靶位点处含突变寡核苷酸的引物,使其与目的基因配对,再加入四种dNTP和Klenow DNA聚合酶,使寡聚核苷酸引物延伸成全长基因,获得的重组双链DNA分子转染细菌后大量复制,进而筛选出阳性突变子。 优点:目的基因可插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因内,通过噬菌体表面展示技术可方便地筛选出重组子。 不足之处: (1)对19种氨基酸须分别设计各自寡核苷酸引物,费用较大; (2)大肠杆菌宿主细胞存在自身修复系统,因突变修复而难以筛选出突变子; (3)不适合多点饱和突变。 2、盒式诱变 该法利用一种含有突变靶位点和特殊酶切位点序列的密码子盒(codon cassette)来引入突变序列。由于密码子盒可从正反两方向插入目的基因,因此只须11种密码子盒就可替换产生全部20种氨基酸以达到点饱和突变的效果。 该法突出优点是:一个靶位点两侧的酶切位点经过改造可替换成其它氨基酸,相对于寡核苷酸定向诱变而言节省了引物合成的费用,而且可对多个非邻近位点同时进行点饱和突变。 不足之处是: (1)每个靶位点两侧需分别设计酶切位点; (2)密码子盒两端存在重复序列,因自连而增加突变子筛选难度。 3、基于PCR的点饱和突变 1）、突变引物诱变 当靶位点位于基因两端时,可设计这样一对引物扩增目的基因,正向引物为靶位点突变的兼并引物,反向引物为目的基因序列引物。突变引物诱变是基于PCR的点饱和突变中最简单、最快速的方法,但难以对基因中间的靶位点进行点饱和突变。 2）、重叠延伸PCR 　 设计一对简并引物,使其在靶位点附近有一定程度的重叠(图2中的B、C引物),分别与基因5′和3′端引物(图2中的A、D引物)组合,扩增含突变靶位点的上游片段和下游片段,然后将上下游片段在靶位点处交错,互为模板重叠延伸成全长基因。 　 该法主要优点: (1)能方便地对基因中间的靶位点进行点饱和 突变,解决中间靶位点不易突变的难题; (2)突变与重组同时完成,大大缩短实验周期; (3)不存在突变修复问题,容易筛选出全部突变子; (4)可方便地进行多点饱和突变。 不足之处是:当靶位点靠近目的基因末端 时,分段扩增的片段过小而不易回收;分 别扩增上下游片段时,不能使用具有无模 板加尾性能的pol I型耐热DNA聚合酶,而 应使用无加尾性能的高保真α型或混合 型耐热DNA聚合酶。 3、质粒扩增诱变 在靶位点处设计一对反向兼并引物,扩增质粒全长片段,然后用DpnI消化含甲基化位点的亲本链,新合成链由于没有甲基化位点而被保护。 由于此法需要扩增质粒全长序列,因此在PCR反应中应特别注意扩增的保真性,一般采用高保真α型或混合型耐热DNA聚合酶。 常用点饱和突变技术特性的比较 三、非理性设计—蛋白质（酶）定向进化 （一）进化策略特征： （1）进化的每一关键步骤都受到严密控制。 （2） 除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径； （3）能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。 （二）定向进化常用方法 1.易错PCR为代表的无性进化 2.DNA改组技术为代表的有性进化 3.基因家族之间的同源重组 4.杂合酶 (1)杂合酶 (2)构建策略 1、 易错PCR 是一种简便快速地在DNA序列中随机制造突变的方法，它通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。本法的关键在于选择适当的突变频率，当突变频率太高时，几乎无法筛选到有益突变；若突变频率太低，野生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到理想的突变体。 费