第一讲 细胞培养的基本要求.pptVIP

一、体外培养的概念 就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 二、细胞培养的基本要求 由于体外培养的细胞没有抗感染能力， 因此防污染是决定培养成功的首要条件。 一切操作需要保证无菌和有条不紊。 准备室 无菌间 操作间 培养室 分析室 显微镜 离心机 1000转/分 程序降温方法是利用程序降温盒设定程序由室温降低至-80℃，最后再放置到液氮槽中长期保存。 滤 器 清洁液的配制 培养基 细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。 无毒、无污染 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。 对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。 ① 天然培养基 天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。 但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清。 血清(serum) 血清种类:主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。 牛血清分为小牛血清 (calf serum ，CS) 、胎牛血清 (fetal bovine serum，FBS) 。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新生小牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10-30天的小牛。 胎牛血清：（进口血清）要求剖腹取胎制成。 国内厂家往往不能做到，经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。 血清的使用 使用前处理：大部分血清在使用前必须灭活处理，即56℃水浴锅处理30分钟。灭活的目的是灭活血清中的补体和支原体。 血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养，前提是确认血清中不含补体成分。 ②合成培养基 基本培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，可以用血清来终止胰蛋白酶的消化 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素P.＋链霉素S.联合使用。培养基内P.S.最终使用浓度为每毫升100单位或微克。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定 比较合理的建议是，在常规的细胞培养中不要使用抗生素。只有在培养污染源很多（比如组织培养），或者培养非常珍贵的细胞株时才使用抗生素 完全培养基的组成 基础培养基(1640或DMEM) 80％一95％ 血清 5％一20％ NaHCO3 2.0 －3.7 g/L P. S. 各100单位／毫升 HEPES 2.0 －5.98 g/L 培养基的配制 RPMI-1640/DMEM培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位／毫升 加三蒸水 至 1000ml，4℃过夜 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10％） ◆ 常规清洗方法：水中浸泡--- 2%NaO