protein一级结构3课时.pptVIP

蛋白质的一级结构(Primary structure)包括： 组成蛋白质的多肽链数目； 多肽链的氨基酸顺序； 以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置； 非aa成分； 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。 蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 间接法：通过测定蛋白质之基因的核苷酸顺序，用遗传密码来推断aa的顺序。这是因为核苷酸的测序比蛋白质的测序工作要更方便、更准确。 直接法：用酶和特异性试剂直接作用于蛋白质而测定出aa顺序 1，样品必需纯（97%以上）； 2，知道蛋白质的分子量； 3，知道蛋白质由几个亚基组成； 4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol。 末端氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。产物可用气-液色谱法进行鉴定。这个方法最大的优点是剩下的肽链仍是完整的，可依照此法重复测定新生的N末端氨基酸。现在已经有全自动的氨基酸顺序分析仪，可测定含20个以上氨基酸的肽段的氨基酸顺序。缺点是不如丹磺酰氯灵敏，可与之结合使用。 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 确定C端和N端的肽段，如何确定中间的肽段。　①　无原则用两种 or 两种以上不同方法断裂多肽样品。使成两套 or几套肽段　　　不同的断裂方法使指断裂的专一性不同，即切口是彼此错位的，因此两套肽正好相互跨过切口而重叠，这种肽段称重叠肽。　②　借助重叠肽可确定肽段在原多肽链中的正确位置，拼凑出整个多肽链的AA顺序。 1． 把蛋白质分子中的全部二硫键拆开 2．用对角线电泳技术分离肽段混合物 有一个肽，用胰蛋白酶水解得：A:Met-Glu-Leu-Lys；B:Ser-Ala-Arg；C:Gly-Tyr三段片段，用BrCN处理得：D：Ser-Ala-Arg－Met；E：Glu-Leu-Lys-Gly-Tyr两组片段，按肽谱重叠法推导出该九肽的序列？ 一个四肽，经胰蛋白酶水解得两个片段，一个片段在280nm附近有强的光吸收，并且Pauly反应和坂口反应（检测胍基的）呈阳性。另一片段用溴化氰处理释放出一个与茚三酮反应呈黄色的氨基酸。写出此四肽的氨基酸序列。 有一个七肽，经分析它的氨基酸组成为Lys, Pro, Arg, Phe, Ala,Tyr和Ser，此肽未经糜蛋白酶处理时与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸，经糜蛋白酶作用后，此肽断裂成两个肽段，其氨基酸组成为Ala,Tyr,Ser和Pro, Phe, Lys,Arg。这两个肽段分别与FDNB反应，可分别产生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应，同样能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别为Arg, Pro和Phe,Tyr, Lys, Ser, Ala。试问此七肽的一级结构是怎样的。 * * 第四节、蛋白质一级结构的测定 测定蛋白质的一级结构的要求 （一）蛋白质测序的策略 1）、测定蛋白质分子中多肽链的数目； 2）、多肽链的拆分； 3）、断开多肽链内的二硫桥； 4）、测定每条多肽链的氨基酸组成； 5）、鉴定多肽链的N-末端和C-末端； 6）、多肽链断裂成多个肽段； 7）、测定每个肽段的氨基酸顺序 8）、重建完整多肽链的一级结构 9）、确定原多肽链中二硫键的位置 （二）序列分析中的重要方法和技术 （1）N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定 （2）二硫键的拆开和肽