第七章干细胞研究及其应用2.pptVIP

3. ES细胞的鉴定 -- 细胞的形态结构 -- 核型分析 -- 碱性磷酸酶（AKP）染色 -- SSEA-I 免疫荧光标记 -- 分化能力检测 体外分化试验 体内分化试验 嵌合体形成试验 核移植试验 ES细胞形态学鉴定 依ES细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对ES细胞进行初步鉴定。 核型分析 ES细胞具有正常二倍体核型， 可用核型分析进行检验 碱性磷酸酶（AKP）染色 *常用快绿（Fast Green Staining)染色法， *对照以已建系ES细胞（或小鼠的脱带桑椹胚 或囊胚）作为阳性对照， *作用液中不含α-萘酚磷酸钠为阴性对照。 *结果判定阳性对照ES细胞染成棕色，阴性对 照无色。小鼠3．5日龄胚胎ICM为强阳性。 SSEA-I 免疫荧光标记 第1抗体，SSEA－1（鼠抗ES细胞单克隆抗体），1:100稀释；第2抗体，羊抗鼠 1：10稀释;封闭液，羊抗兔lgG。 步骤①杜氏PBS洗3次,2％Triton作用20 min； ②再以杜氏PBS洗3次,封闭液中置20min； ③以杜氏PBS洗3次，加第1抗体于4℃过液； ④以杜氏PBS洗3次，加第2抗体于30℃温箱置30min； ⑤再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。 样本在激光共聚焦图像系统下观察, 结果依细胞是否出现荧光作出判断。 分化能力检测 体外分化试验 体内分化试验 嵌合体形成 核移植 4.胚胎干细胞的制备 1. 直接由动物体内获取囊胚再分离ICM的方法，这样得到的囊胚数量少，质量也可能不高，由此会影响分离ES细胞的效率。 2. 卵细胞去核培养、转入体细胞核，体外培养，获得高质量的去透明带囊胚，由此囊胚进一步分离得到胚胎干细胞。 目前已证明，小鼠、兔、羊。猪、牛等多种动物的桑 椹胚以前以及囊胚的ICM细胞具有发育的全能性，因 此桑胚胚或囊胚成为分离ES细胞的常用材料。 ES细胞的分离 早期胚胎的获取及处理方法 原始生殖细胞的获取 分化抑制物的选择, 包括：饲养层（feeder lopr）， 条件培养基（conditioned medium， CM） 和分化抑制因子（differentiation inhibitory activity， DIA） 基础培养基的选择 添加物的选用 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）也可被称为多能干细胞（pluripotent stem cell，PSC），是胚胎或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后筛选出的具有发育全能性的细胞。其可以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞，甚至形成复杂的组织和器官，其建系、体外扩增、定向诱导分化、调控机制、细胞性能、组织重构等方面的研究将在未来的人体发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源 5.目前胚胎干细胞的研究 ES细胞的应用前景及面临的难题 1．ES细胞的应用前景 （1）ES细胞在动物克隆及人类治疗性克隆中的应用 （2）在转基因动物中的应用 （3）制备嵌合体动物 2．ES研究面临的难题 （1）体外培养ES 细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态。如何平衡这一对矛盾, 必须筛选适宜的培养条件。目前在ES细胞研究中存在着建系成功率也不高等问题, 只在小鼠中建立了稳定的ES细胞系，家畜、人类细胞系建立的最佳条件仍无定论。 （2）ES 细胞高度未分化, 具有形成畸胎瘤的可能性, 因此在使用ES 细胞进行治疗前必须首先体外诱导ES 细胞分化产生某种特异的组织细胞或设计自杀基因, 当移植的细胞向肿瘤发展时, 自杀基因能启动自毁机制使其凋亡。但如何诱导ES细胞定向分化成单一类型的分化细胞, 是至今仍未解决的难题。因此，必须寻找各种细胞定向诱导分化的条件和方法，以及不同干细胞的表面标志和分选技术，从而得到所需要的细胞或组织。 （3）ES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程, 很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。即便是发育