第15章动物干细胞技术.ppt

作业 试述ES细胞和成体干细胞的特点； 试述ES/EG细胞体外诱导分化的原理和方法,需要注意哪些问题？ 2.特异性标志分子的表达 1）Oct-4 是含pou结构域的转录因子家族中的一员，被广泛的应用于鉴定胚胎干细胞是否处于未分化状态。 它最早表达于8细胞时期，在每个卵裂球中都可检测到其表达产物；囊胚期后，其表达局限于内细胞团细胞；到原肠形成后，只能在原始生殖细胞中检测到它的表达。 未分化的ES细胞OCT-4 染色阳性 2）碱性磷酸酶（AKP） 未分化的ES细胞表面标记AKP呈阳性，细胞一旦分化，则AKP呈阴性。 3）阶段特异性胚胎细胞表面抗原（SSEA） SSEA是一种糖蛋白，在未分化多能干细胞中SSEA常为阳性。 未分化的ES细胞AKP 染色阳性 未分化的ES细胞SSEA-3 染色阳性 3.分化潜能的检测 1）体外分化潜能检测 包括自发分化和定向诱导分化。 自发分化是将ES∕EG细胞接种于缺乏饲养层细胞的琼脂平板上培养3~4天形成类胚体，培养8~10天，形成囊状胚体。 ES细胞的定向诱导分化是在ES细胞悬浮培养液中添加相应的分化诱导因子，使ES细胞向特定的方向分化。 常见的分化诱导剂有视黄酸、3-甲氧苯丙胺和神经生长因子等。 类胚体 2）体内分化潜能检测 取与ES细胞同一品系的小鼠，进行腹股沟接种或腹腔注射，一定时间后接种细胞处出现肿块并进一步增大。在肿块切片上就可观察到多种类型的分化细胞。 4.嵌合体的形成 利用桑葚胚聚合法和囊胚注射法将ES细胞注射到受体胚胎中，经胚胎移植产生嵌合体动物。嵌合体动物可以通过皮毛颜色、蛋白质、同工酶等进行检测。 第三节ES/EG细胞体外诱导分化 ES/EG细胞维持未分化状态的机制 ES细胞体外分化的基本原理 ES细胞体外分化方法 1 2 3 ES/EG细胞维持未分化的分子机制 LIF/STAT3通路 Oct-4 一、 二、 几个重要的概念 LIF（ leukemia inhibiting factor ）：一种多功能细胞因子，在体外具有抑制胚胎干细胞自主分化的能力，并能够促进8细胞期以后的桑葚胚至着床前胚胎的发育，促进滋胚层细胞增殖和内细胞团生长。 STAT3(single transducer and activator of transcrption):转录信号转导及激活因子。 LIF/STAT3通路 LIF受体（LIFR）:广泛分布在体细胞上，是一种分子质量为250kDa的糖蛋白，由LIFRB和gp130组成。 gp130:一种跨膜糖蛋白，分子质量为130kDa,与LIFRB结合后，可使LIFR由低亲和力向高亲和力转换。 LIF/STAT3通路 LIF与LIFR结合后，可激活结合于gp130胞内近膜部分的JKA激酶，活化的JKA激酶催化gp130胞质区的酪氨酸酸化，进而激活转录因子STAT，活化STAT形成同源二聚体并移向核内，与核内特异的靶细胞基因位点结合并激活STAT1与STAT3，STAT3是维持ES细胞不分化状态的决定性因子，被激活后就足以抑制ES细胞的分化。 LIF/STAT3通路机制 Oct-4基因表达上调2倍可使ES细胞分化为原始的内胚层细胞，表达程度不变可维持ES细胞未分化状态，表达下调可使ES细胞分化为滋养层细胞。 Oct-4基因的表达是维持ES细胞未分化状态的必要条件，但不是充分条件，还需LIF等其他因子的协同作用。 Oct-4在维持细胞未分化中的作用 在ES/EG细胞中，LIF/STAT3转录和转录因子Oct-3/4对维持ES细胞的未分化起关键作用。 LIF等因子通过复合物gp130磷酸化效应分子的酪氨酸残基，将信息传至细胞核内相应的靶基因上而使细胞处于高度增值状态，同时转录因子Oct-3/4及相关基因的表达也可以使ES细胞维持未分化状态。 总结： ES细胞在体外的培养过程中能够在有饲养层细胞或分化抑制因子（DIA），白血病抑制因子（LIF)等存在的条件下维持其未分化的状态，保持发育全能性，可以无限增 殖。 ES细胞体外分化的基本原理 但一旦出去饲养层细胞，除去这些抑制分化因子，或者添加一些诱导分化因子（维甲酸RA，神经生长因子NGF等），就会向各类可能的细胞发生定向分化。 对小鼠ES细胞进行各种方式的诱导分化，可以获得神经细胞,造血祖细胞，成骨细胞，肝细胞，角质细胞，胰岛细胞和滋养细胞等各种细胞。 神经细胞 造血干细胞在一定微环境和某些因