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　　丁酸钠对食管癌细胞增殖的影响论文 尹惠卿 张岚 贺付成 张云汉 高冬玲 【摘要】 目的: 观察丁酸钠对食管癌EC9706细胞增殖、细胞周期及NDRG1蛋白表达的影响. 方法: 采用0.5 mmol/L丁酸钠作用于食管癌EC9706细胞, 用MTT法检测处理不同时间时细胞增殖的变化，采用流式细胞仪检测细胞周期的变化，采用免疫组化方法检测NDRG1蛋白表达的变化. 结果: ①MTT实验结果显示，丁酸钠作用1～5 d时各组吸光度均低于对照组，经统计学处理差异有显著性意义（P 0.05）；丁酸钠不同作用时间的细胞增殖抑制率分别为：1 d组21.2%，3 d组23.5%，5 d组25.6%，且随作用时间延长抑制率升高. ②细胞周期检测结果为（%）: G1期细胞:对照组57.00±1.10.freelica heidelberg公司），RPMI 1640细胞培养基（Gibco BRL公司）,胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），羊抗人NDRG1多克隆抗体（Santa Cruz生物技术公司），丫啶橙(Sigma公司)，CO2孵育箱（美国Forma Scientific公司），流式细胞仪（德国Partec PAS公司），Fax250酶标仪（英国Stat公司）. 1.2方法 1.2.1细胞培养 将人食管癌EC9706细胞单层贴壁生长于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液中，种植于含盖玻片的六孔板及75 cm2培养瓶中. 37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养，隔日换液，取对数生长期细胞进行试验. 1.2.2MTT实验 取对数生长期的EC9706细胞,调整细胞密度为7.5×107/L,按每孔0.2 mL接种于96孔细胞培养板中. 设空白对照组和0.5 mmoL/L丁酸钠实验组,每组均设10个复孔. 实验终止前4 h向细胞液中加入MTT 20 μL,细胞被染色后以二甲亚砜200 μL溶解甲瓒颗粒,于酶标仪上测定A492 nm. 实验重复2次. 细胞抑制率= ［(A对照-A实验)/A对照］×100%. 1.2.3丁酸钠处理及细胞周期检测 用RPMI 1640培养液将丁酸钠调终浓度为0.5 mmol/L,对照组为不含丁酸钠的培养液. 取丁酸钠作用1, 3, 5 d的细胞爬片及对照组细胞爬片从六孔板取出后经pH 7.4的PBS冲洗，800 mL/L丙酮固定30 min后用中性树胶黏于载玻片上，4℃保存，用于免疫组化实验. 分别取丁酸钠作用1,.freelL/L乙醇1.0 mL固定细胞用于细胞周期测定. 上机前将细胞离心洗涤制成单细胞悬液,加丫啶橙染色,暗室放置,300目尼龙膜过滤,用流式细胞仪检测细胞周期分布. 1.2.4细胞免疫组织化学染色 采用SP试剂盒进行免疫组化实验. 按说明书步骤进行操作，DAB显色，苏木素复染，光镜观察细胞显色强度. 结果判定：在高倍镜下观察免疫组化着色情况，以信号强弱评定NDRG1表达的强弱. 统计学处理： 采用SPSS 11.0软件进行统计学处理，数据均采用x±s表示,检验水准α=0.05. 2结果 2.1MTT检测不同时间的各组平均吸光度值均低于对照组，其差异有显著性意义（P 0.05，表1）；随丁酸钠作用时间延长，其抑制率升高.表1丁酸钠对人食管癌细胞EC9706的增殖抑制作用确良（略） 2.2丁酸钠对食管癌细胞细胞周期的影响 实验组G1期细胞比例与对照组比较明显增高,而S,M期细胞比例减少，经统计学处理，差异有显著性意义（P 0.01,表2）.表2丁酸钠对食管癌EC9706细胞周期的影响（略） 2.3丁酸钠对食管癌细胞NDRG1蛋白表达的影响 免疫组化染色结果显示，在作用1～5 d时，细胞胞质黄色着色较对照组明显加深，且随作用时间延长而增强（图1）. 3讨论 食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤，食管癌的治疗方法除手术治疗、放疗等方法外，还有许多新的治疗方法，如基因治疗、免疫治疗、抗血管生成治疗、诱导分化治疗等［6］. 其中诱导分化治疗是肿瘤化学治疗的一个新领域. 诱导分化是指恶性肿瘤在体内外分化诱导剂存在下，细胞恶性行为降低，恶性表性发生改变，形态学趋于正常，呈现出向良性或趋向良性细胞分化的现象. 利用分化诱导剂可使肿瘤细胞部分或全部恢复分化潜能，转变为正常细胞或导致细胞凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的. 我们的结果表明，丁酸钠作用1～5 d后细胞增殖的抑制率由17.4%增加到23.8%，表明丁酸钠可抑制食管癌细胞增殖，实验中增高丁酸钠浓度至1 mmol/L 2～3 d（结果未列出），可见培养的细胞死亡显著增多，说明其抑制率随丁酸钠浓度增加而升高；其增殖抑制作用与丁酸钠使食管癌EC9706细胞细胞周期发生变化有关，丁酸钠可使G1期细胞增加；S期细胞比例