一种胶质瘤相关的酸性成纤维细胞生长因子mRNA同源物论文.docVIP

　　一种胶质瘤相关的酸性成纤维细胞生长因子mRNA同源物论文 .freelRNA，反转录成cDNA.采用基于PCR的消减杂交法获得差异的cDNA，并经多聚酶链反应扩增后克隆入T载体测序.用打点杂交法验证差异克隆. 结果 获得一胶质瘤相关的酸性成纤维生长因子基因同源物. 结论 该酸性成纤维生长因子基因同源物是酸性成纤维生长因子mRNA的不同拼接产物，可能参与胶质瘤的形成. Keya;hybridization;tumor related gene Abstract:AIM To search for glioma related genes.METH┐ODS Glioma sample and normal brain tissue of a patient RNAs a-specific cDNA plified by polymerase chain reaction（PCR）.The PCR products olog of acid fibroblast groRNA or tissue but not in normal brain tissue.CONCLUSION The neight be involved in glioma genesis. 0 引言 胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，占颅内肿瘤的31.8%［1］ ，严重地威胁着人类健康.多年来许多学者应用各种方法致力于肿瘤相关基因的寻找与研究，渴望向认识肿瘤的发病机制，最终攻克之迈近.目前已经发现EGFR.freelg取自一胶质瘤手术患者. 1.2 mRNA的分离及反转录 按Promega公司的mRNA磁性分离试剂盒操作手册进行，所得mRNA使用Gibco公司的SuperscriptⅡ反转录酶.参照Clontech公司的SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit方法进行（3’锚定引物为:TACGGCTGCGA-GAAGACGACAGAAT30（A/G/C）（A/G/C/T））. 1.3 扣除探针的制备 （正常脑组织）PCR条件:20μmol L-1 biotin-21-dUTP（Clontech），200μmol L-1 dNTP，1μg oligo-dT（15-18），1μL反转录模板，50μL反应体积.PCR参数为:95℃，20s;40℃，5min;72℃，3min;40个循环. 1.4 杂交、除盐及小片段 将5μL胶质瘤cDNA加到100μL扣除探针PCR产物中，在6×SSC及5g L-1 SDS的条件下65℃杂交18h.将40μL杂交液加到Sephacryl S-400spin column（Promega），离心收集液体. 1.5 除去杂交体及扣除探针 将上述液体（40μL）加到0.1mL Streptavidin MagneSphere Paramag-ic Particles（Promega）（将1mL磁珠悬液用0.5×SSC洗涤三次，再悬于0.1mL0.1×SSC）中，室温结合2min，65℃温育5min减少非特异性杂交，在磁场作用下分离出上清作为PCR模板. 1.6 目的cDNA的特异扩增 PCR条件:400nmol L-1 引物（TACGGCTGCGAGAAGACGAC-AGAA）;200μmol L-1 dNTP，40μL杂交分离后的上清;Klen Taq DNA polymerase1U，50μL反应体积，PCR参数为:95℃，15s;68℃，5min;25个循环. 1.7 PCR产物的回收、克隆与鉴定 采用Clontech公司的胶回收试剂盒回收PCR产物.将PCR产物克隆入T easy载体（Promega），以EcoRⅠ酶切鉴定. 1.8 打点杂交验证 PCR方法用［α-32 P］dCTP分别标记胶质瘤和瘤旁正常脑组织cDNA为杂交探针.碱裂解法提取质粒，沸水浴10min后迅速转入冰浴中使之变性.将约1g的变性DNA点在硝酸纤维素膜上（两份），室温晾干后，80℃烤2h，使之固定.分别与胶质瘤和瘤旁正常脑组织探针进行杂交，压磷屏9h后扫描. 1.9 序列测定及分析 按照ABI310DNA自动化测序仪要求进行反应和测序.通过inter利用GeneBank和S］.Beijing:People Surgeon Publishing pany，1998:5. ［2］Huang YG，Deng YC.Progress of study in molecular and ge-ic of human glioma ［J］.Xiandai Zhongliu Yixue（J Mordern Oncology），1996;4（1）:5-6. ［3］