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第十二章 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography） * * §1 概述 一、现代HPLC的特点 由的 （1）高压：液体作流动相，流经色谱柱时所受的阻力大， 为加速，配备高压输液设备 （2）高速：分析时间为几~几十分钟 （3）高效：塔板数30000块/米，普通色谱法几千块/米 （3）高灵敏度：紫外检测器：检测限10-9g/mL 荧光检测器：检测限10-13g/mL 二、HPLC与GC的区别 1. 分析对象范围广 GC：对象：气体或低沸点的化合物，占20% HPLC：可用于沸点高、摩尔质量大、热稳定性差的物质，占80% 2. 流动相选择余地大，并对组分有亲和力，可增加选择性 GC：惰性气体，对组分无亲和力 HPLC：不同极性液体，对组分有亲和力，与固定相竞争组分， 可提高选择性 3. GC：高温 HPLC：室温 缺点：仪器昂贵，操作严格 §2 理论基础 一、涡流扩散项A 使用颗粒较小且均匀的固定相可提高柱效 二、纵向扩散项B/u r：阻塞因子（常数），大小与组分在色谱柱中的扩散程度有关 Dm：组分分子在流动相中的扩散系数 Dm只有Dg的万分之一～十万分之一，当u≥0.5cm/s时，纵向扩散可以忽略 三、传质阻力项Cu 流动相传质阻力项 固定相传质阻力项 ：流动相迁移传质项。使用颗粒小且均匀的固定相 可降低这一项 ：柱系数，与色谱柱的直径、形状及固定相的结构有关 ：流动相滞留传质项。 ：柱系数，与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数 及分配比有关 ：固定相的液膜厚度 ：常数 ：组分分子在固定相中的扩散系数 §3 HPLC仪器 四大主要部分： 高压输液 系统 进样系统 分离系统 检测系统 辅助部分： 梯度淋洗 自动进样 数据处理 一、高压输液 系统 1. 组成：贮液器、高压泵、梯度洗脱装置 2. 贮液器：贮存流动相 3. 高压泵： 要求：（1）输出压力足够，使流动相顺利通过色谱柱 （2）输出流量恒定，精度1～2%（恒压泵、恒流泵） （3）流量范围广，流速可调 （4）压力平稳，脉动小 4. 梯度洗脱装置：（相当于气相色谱中的程序性升温） 通过连续改变流动相的极性、离子强度、pH值以改变被测组分的相对保留值，进而提高分离效率，提高选择性 二、进样系统 1. 隔膜注射进样器（微量注射器） 优点：装置简单、价廉、死体积小、可任意改变进样体积、 进速、不易造成峰扩张 2. 高压进样阀（六通阀） 缺点：重现性差，易使试液渗漏 优点：进样量可变范围大，进样准确，重现性好 缺点：易造成峰扩张，要改变进样量时，需要换不同体积的 定量管 三、色谱柱（分离系统） 1. 组成 { 柱管 固定相 2. 色谱填充方式 { 干法：比重小，颗粒直径在50 um左右 湿法：粒度非常小的固定相 四、检测系统 { 溶质型检测器：只对溶质有响应 紫外检测器 荧光检测器 电化学检测器 { 总体检测器：对试样和洗脱液同时响应 { 示差折光检测器 电导检测器 1. 紫外检测器 适用对象：对紫外光和可见光有选择性吸收的物质 优点：灵敏度高（检测限：10-9 g/mL），对温度T、流动相 流速u不敏感，适用于梯度洗脱 缺点：不适用于无紫外和可见吸收的被检组分 固定波长型：汞灯作光源：254 nm， 280 nm { 可调波长型：紫外-可见分光光度计 （双光束分光光度计）