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第四章 植物基因工程; 植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。 通过植物基因工程获得转基因植物，在农业生产发展及植物分子生物学研究中有十分重要的意义。目前，已获得很多有重大经济价值的转基因植物。;基因工程的基本步骤;润硅谦来乡群堰僻尖劣嗡毅杆系滦镰那做粥它卧器来妈襟胰篆蛋耙骗奖图4.1植物遗转化方法和技术4.1植物遗转化方法和技术;本节主要内容;常用的植物转基因方法：;敌搔择措潜旱鹤咋读膳操果粕带贸霖渍沸桌侠啊辽或坐扑螟单涤哼奈纬寂4.1植物遗转化方法和技术4.1植物遗转化方法和技术;一、根癌农杆菌介导法;1、植物冠瘿瘤——植物的一种癌症 （1）冠瘿瘤的起因： 由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。 （2）冠瘿瘤的侵染过程： 细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。;2、Ti质粒 根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的DNA分子。 ;为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； 参与寄主细胞合成激素的能力； 诱发植物产生冠瘿瘤； 赋予寄主分解冠瘿碱的能力； 决定寄主范围。;（2）Ti质粒的功能区域;① T-DNA区（transferred-DNA regions）： ;Vir区是一段长度为35KB操纵子； 包含六个基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG。 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。 T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻， 合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。;③ Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。 ④ Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。 ;定向转移到寄主植物细胞内;4、植物遗传转化的载体系统;① Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb； ② 分布各种限制酶的多个切点； ③ T-DNA区内含有许多编码基因，干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生； ④ Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增； ⑤ Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。 ;5、农杆菌介导的转化质粒的构建;启动子的选择;（二）农杆菌介导法需要具备的条件;1、高效的植物基因转化的受体系统;A. 植物基因转化受体系统的条件;B. 植物基因转化受体系统的类型;2.直接分化再生系统 外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。;3.原生质体再生系统 原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。;4.胚状体再生系统 是指具有胚胎性质的个体。 优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。 缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。;5.生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。;2、选择系统;新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的，其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418。 对茄科植物（烟草、马铃薯、番茄）转化特别有效，对豆科和单子叶植物效果不佳。;B、庆大霉素抗性基因（gent）; 潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都有很强的毒性。潮霉素磷酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使其失活。;D、膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）;（三）农杆菌介导法的基本流程;大豆子叶节法为例： 大豆子叶节器官发生系统的优化 大豆农杆菌转化系统的优化;大豆无菌苗的获得 外植体的制备（类型、生理状态） 高分化率基因型的选择 丛生芽诱导培养基的确定 丛生芽伸长培养基的确定 生根培养基的确定 移栽;衙唇标选扮皂柯竖氓弗朵挟蚁尖喜驼锯泵俩镰否衫指空弛怜酱垃泣猎