实验二 微生物的诱变育种.ppt

实验二 微生物的诱变育种 一、教学目标及基本要求 1. 理解诱变剂对微生物的杀菌和诱变双重生物学效应； 2. 学习紫外线诱变育种的方法。 二、实验原理 诱变育种 紫外线的生物学效应主要是它能引起DNA结构的变化而造成的。 紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应，随着紫外线照射时间的增加，杀菌率和突变率随之提高。但当照射时间延长到某一程度时，继续延长照射时间，其杀菌率虽然增加，突变率却下降。 二、实验原理 紫外线的强度单位(剂量)为尔格/mm2，由于测定困难，在实际诱变育种中，常用紫外线照射时间或细胞的死亡率表示相对剂量，其中以细胞死亡率表示具有实际意义。 本实验以枯草芽孢杆菌为出发菌株，以营养缺陷的突变作为诱变效应的指标，测定紫外线诱变剂的最适剂量。以照射时间为横坐标，以细胞存活率或死亡率和突变率为纵坐标作图，突变率最高值相对应的照射时间即为最适剂量。 三、实验材料 1. 菌种 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 2. 培养基 肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1），细菌基本培养基（附录Ⅱ-1.9） 3. 其它 生理盐水，诱变箱，磁力搅拌器，涂布棒，离心管，离心机，培养皿等。 实验路线 四、实验内容 1. 菌体的培养 取斜面菌种1环，接种于盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)16~18h。取1ml培养液转接于另一只盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)6~8h。 2. 细胞悬浮液的制备 取10ml培养液，3500/min离心10min，收集菌体，沉淀用10ml生理盐水洗涤离心2次，之后将菌体充分悬浮于12ml生理盐水中。 四、实验内容 3. 活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度 取1ml细胞悬浮液，逐步稀释为10-1、10-2、10-3……。取最后3个稀释度的菌液各1ml，置于无菌空平皿中，然后倾注15ml融化并冷却至45~50℃的肉汤固体培养基，轻轻充分混匀，凝固后于37℃倒置培养1~2天，计数每皿的菌落数（每个稀释度作三个平行）。按下式计算每毫升细胞悬浮液菌体的浓度（N0）。 菌体浓度(个/ml) = 菌落数(按杂菌总数计数原则)×稀释倍数 四、实验内容 4. 诱变处理 (1) 取10ml菌液于φ90mm的培养皿中（带有磁棒），将皿放置于诱变箱内的磁力搅拌器上。 (2) 开启紫外灯，预热20min，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射15、30、45、60、75、90s。 (3) 取不同时间诱变处理的菌液1ml，以肉汤固体培养基平板，按照上述菌落计数的方法进行适当稀释后，采用肉汤固体培养基倾注法测定处理液中存活的细胞浓度（每个照射剂量做三个稀释度，每一稀释度平行做三个平皿）。将结果填入下表 四、实验内容 照射时间 稀释度 平板菌落(个/ml) 细胞浓度平均值N1 (个/ml) 存活率(%) (N1/N0) 平板1 平板2 平板3 15s ① ② ③ 30s ① ② ③ 45s / 90s 0s(对照) ① ② ③ 100 紫外线对枯草芽孢杆菌存活率的影响 五、结果与讨论 实验选择诱变时间时，全班共同绘制一条致死曲线，每个组或几个组选择一个诱变处理时间，最后统一进行绘制。 一、每组准备东西： （1）完全培养基：液体25mL/△250, 3个，6层纱布封口 固体300mL/△500, 1个 （2）生理盐水：10mL/支, 10支 9mL/支, 20支，用移液管分装 5mL/支, 2支 2mL/支, 1支 （3）液体无N基本培养基 10mL/△100 , 1个 液体2N基本培养基 10mL/△100 , 1个 （4）固体基本培养基 50mL/△250, 1个 固体限制培养基 100mL/△250，1个 （5）包扎所有移液管 （6）包扎两支涂布器 （7）包扎剩余平板 二、培养基配方： (1) 细菌完全培养基（CM） 葡萄糖0.5%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，蛋白胨1%，MgSO4?7H2O 0.02%（配制时添加1%体积MgSO4母液即可），PH7.2。 (2) 细菌基本培养基（MM）葡萄糖0.5%，MgSO4?7H2O 0.02% （配制时添加1%体积MgSO4母液即可），柠檬酸钠0.1%，(NH4)2SO4 0.2%，K2HPO4 0.4%。 注意：使用的器皿要洗净，用水冲洗2~3次。 (3) 无氮基本培养基