发酵液的预处理细胞破碎与固液分离.pptVIP

管式离心机 2.2 细胞破碎 胞内产物：胞内酶（青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶），脂类，甾族化合物（萃取法提取），遗传工程菌生产的蛋白质及某些抗生素。 图2.8 真核细胞结构示意图 细胞壁 叶绿体 高尔基体 线粒体 核糖体 内质网 核 细胞膜 2.2.1 细胞的结构 动物、植物和微生物细胞的结构相差很大。 生物细胞 类型 G+细菌 G-细菌 酵母菌 霉菌 植物细胞 组成 肽聚糖 (40-90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1-4%) 肽聚糖 (5-10%) 脂蛋白 脂多糖 (11-22%) 磷脂 蛋白质 葡聚糖 (30-40%) 甘露聚糖 (30%) 蛋白质 (6-8%) 脂类 (8.5-13.5%) 多聚糖 (几丁质) (80-90%) 脂类 蛋白质 初生壁 次生壁 （纤维素，半纤维素，木质素） 图2.9 细胞破碎机理 2.2.3 细胞破碎技术 2.2.3.1 机械破碎 高压匀浆器 球磨机 超声波破碎 非机械方法 ：辅助方法 2.2.3.2 化学和生物化学渗透 （1）酸碱处理；（2）化学试剂处理； （3）酶溶 2.2.3.3 物理渗透法 （1）渗透压冲击；（2）冻结-融化法 工业上常用 实验室常用 2.2.3.1 机械破碎 （1）高压匀浆法 细胞悬浮液 细胞匀浆液 碰撞环 图2.11 高压匀浆器结构简图 阀 阀座 破碎原理： 细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速（可达450m/s)喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。操作压力通常为50-70MPa。 团状或丝状真菌：堵塞 较小的革兰氏阳性菌：太小 含有包含体的基因工程菌：太坚硬 不宜采用高压匀浆法的细胞类型 （2）球磨法 球磨机 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠或氧化锆一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。 微珠填充率是细胞的80-85%，微珠与目标细胞的直径比30-100之间。 细胞悬浮液 微珠 冷却剂 冷却剂 细胞匀浆液 搅拌桨 液珠分离器 图2.13 珠磨机结构简图 玻璃珠 氧化锆 实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。 珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。 胶体磨 德国进口珠磨机（立式） 高速组织捣碎机 细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 特点 超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。 该法在实验室小规模细胞破碎中常用。 （3）超声波法 超声波破碎仪 2.2.3.2 化学和生物化学渗透 酸碱处理 可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。 化学试剂处理 表面活性剂：十二烷基磺酸钠（SDS)，Triton X-100,十四烷基胺盐(CTAB); 螯合剂：乙二胺四乙酸（EDTA），与金属离子结合，如阴性菌外层Mg2+、Ca2+处理的方法; 有机溶剂:如苯、甲苯、丁醇、丙酮、氯仿及尿素。这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。 酶溶法 利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。 优点：专一性强，发生酶解的条件温和。 缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。 （1）细菌：溶菌酶lysozyme 革兰氏阳性菌：溶菌酶 革兰氏阴性菌：溶菌酶+EDTA（破坏脂多糖） （2）酵母：Zymolyase，葡聚糖酶或甘露糖酶 （3）植物细胞壁：纤维素酶 可将化学法与机械法结合起来。 溶菌酶、多糖水解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆法处理6次，破碎率95%以上。 另一种酶解方法，溶胞酶是由微生物本身产生的。 影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。 例 酵母45~50℃，保温20小时。 谷氨酸菌：加0.028M Na2CO3和0.018MNaOH，pH10，3%悬浮液，加热至70℃，保温搅拌20min，自溶。 特点 自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。 自溶作用 干燥法 热空气干燥：适用于酵母，25-35℃热空气吹干后的酵母有部