动物细胞工程北京101中学内部.pptVIP

第三节 动物细胞工程 周斌 2011年3月 一、动物细胞培养 概念：从动物机体中取出相关的组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的环境中，让这些细胞生长和增殖。 理论基础：动物细胞可以在体外增殖 动物细胞培养过程的两个现象 细胞贴壁：悬液中分散的细胞贴附在瓶壁上生长。 接触性抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖。 （二）动物细胞培养条件 1、无菌、无毒的环境 原因：1)离体的动物细胞失去了机体免疫系统的保护，非常容易被微生物感染；2)细胞在代谢过程中积累的产物不能及时排出，容易对自身造成毒害。 措施：1)对培养液、操作工具、培养环境做无菌处理，在培养液中加适量抗生素；2）定期更换培养液。 2、适宜的营养物——培养液 培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、维生素、微量元素、动物血清等。 适用于培养哺乳动物的典型培养基成分 动物细胞培养的有关问题 培养的细胞为什么要取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织？ 动物细胞培养是否体现了细胞的全能性？为什么？ 组织细胞分散用胰蛋白酶，说明细胞间的连接物质的化学本质是什么？为什么要用胰蛋白酶，能用胃蛋白酶吗？ 胰蛋白酶的处理时间能否随机？为什么？ 动物细胞培养的培养基与植物组织培养基有什么不同？动物细胞培养基为什么要加动物血清？需要加什么动物血清？为什么？ （三）动物细胞培养技术的应用 生产蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体。 培养基因工程中使用的受体细胞。 培养细胞用于体外检测有毒物质，判断物质的毒性。如检测致畸、致癌物质。 培养各种正常的或病变的细胞，用于生理、病例、药理等方面研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。如为皮肤大面积烧伤病人培养皮肤细胞进行皮肤移植。 ESC典型的不对称分 裂,具慢周期性和高增殖 性.ESC的标记蛋白是角 蛋白K19. 组织工程皮肤是一个 极热门的话题. 如体外培 养表皮和真皮, 用以修补 皮肤损伤. 人耳小白鼠 组织工程鼻软骨 组织工程耳软骨 荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验 二、动物细胞融合与单克隆抗体 概念：是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，也叫动物细胞杂交。融合后形成的具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。 细胞融合过程中两个细胞膜的变化 显微镜下的细胞融合过程 物理方法：离心、振动、电激 化学方法：PEG 生物方法：灭活的病毒（如仙台病毒） 抗体的传统生产方法的不足： 单克隆抗体制备 第一次筛选得到杂交瘤细胞 细胞合成DNA有两条途径：一为主要途径，利用糖和氨基酸合成核苷酸，氨基碟呤可阻断该途径；二为补救途径，通过磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷合成核苷酸。 骨髓瘤细胞缺乏HGPRT和TK，只能通过一途径合成核苷酸而增殖。淋巴细胞具备两条途径，但不能无限增殖。 使用选择培养基---HAT培养基，此培养基中含有次黄嘌呤（Hypoxathine）、胸腺嘧啶核苷(Thymidine)、氨基喋呤（Aminopterin）。 在HAT培养基中，小鼠瘤细胞因不能合成核苷酸而死亡，B淋巴细胞寿命有限也自然死亡，只有杂交瘤细胞从B细胞获得HGPRT或TK基因,表达得到HGPRT或TK ，利用二途径合成核苷酸而无限增殖，能在HAT培养基上生长繁殖。所以最后存活下来的一定是杂交瘤细胞。 单克隆抗体的概念 单: 单个细胞 克隆: 无性繁殖 抗体: 化学性质单一、特异性强 单克隆抗体的概念：是指单个杂交瘤细胞无性繁殖（克隆）形成的细胞系产生的抗体。 人的单克隆抗体生产存在许多问题： ①致敏问题 人们努力寻求的抗体往往是针对有毒抗原的，无法直接用这样的抗原去刺激某人体，并试图获得相应的B淋巴细胞。 ②杂交瘤细胞不稳定 目前世界上已建立一些人骨髓瘤细胞株，它们和人的淋巴细胞融合后也能产生抗体，然而未能获得像小鼠骨髓瘤系那样理想的株系。产生的杂交瘤细胞存在也不够稳定，抗体效价也不够理想。 ③抗体的生产问题 已建株的细胞在体外培养较困难，若能在体内培养则较容易，这对于动物可以，然而用人的腹腔液培养就不可能。 ④转化细胞不稳定 用病毒转化B淋巴细胞细胞也可建立细胞株系，但传代后只有小部分细胞分泌特异抗体，且细胞随传代递减，很难建立起长期稳定的细胞株。人—鼠细胞杂交也可以，但随着细胞的分裂，人的染色体会大量丢失。 多莉与威尔莫特 三、动物体细胞核移植和克隆动物 概念：将动物的一个细胞(供体细胞)的细胞核，移入另一个已经去掉细胞核的卵母细胞(受体细胞)中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。 理论基础：动物细胞(核)的全能性 克隆动物：用核移植方法培育的动物。 细胞核的吸取 骡