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魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展 报告内容 魏氏梭菌概述 魏氏梭菌毒素研究 综述 革兰氏阳性有荚膜不运动的厌氧大杆菌，芽孢椭圆形,位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体，在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基中有利于形成芽胞（菌体形态） 广泛分布于自然界，同时也是肠道中的常见菌之一，在一定条件下，可引起各种严重疾病 发病急、死亡快，因此对于本病的防制主要用疫苗进行免疫预防 危害：猝死症，家禽坏死性肠炎，人食物中毒及气性坏疽 ；家畜肠毒血症、坏死性肠炎，痢疾 培养特性 本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要求并不太严，2%~10%的CO2条件下，生长更好 在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血液，则生长更好 生长适宜温度为37-47℃，多认为43-47℃为最宜温度，在适宜条件下增代时间仅8min 培养特性 血平板：双层溶血环 内环完全溶血-θ毒素 外环不完全溶血- α毒素 蛋黄琼脂平板：Nagler反应 庖肉培养基：数小时即可见到生长，产生大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色，但不被消化 牛乳培养基：“汹涌发酵”（stormy fermentation） 分型及其依据 根据此菌产生外毒素的种类，可将其分为A、B、C、D和E 5个型 A型菌：α B型菌：αβε C型菌：αβ D型菌：αε E型：αι 魏氏梭菌与相应疾病 其中，A型菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒，也可引起动物的气性坏疽，牛、绵羊、家兔肠毒血症 B型菌主要引起羔羊痢疾； C型菌主要是牛、猪肠毒血症、羊猝狙 D型菌引起羔羊、绵羊、山羊、牛以及灰鼠的肠毒血症； E型菌可致犊牛、羔羊肠毒血症，但很少发生。 纯化 疫苗现状 梭菌类的疫苗有单价苗和多联苗，单价疫苗在实际应用中难以取得很好的效果，原因是致病的梭菌种类较多，而且有的是混合感染，单价苗往往是顾此失彼，不能有效地预防疾病。 国外相继出现了包括产气荚膜梭菌的四联、五联、七联和八联苗梭菌苗，不仅把梭菌苗联合起来，而且还把所梭菌苗与需氧菌苗(如巴氏杆菌苗、沙门氏杆菌苗)联合起来，甚至与病毒苗(如羊痘疫苗)联合起来进行防疫。 疫苗现状 国内首先出现的是羔羊痢疾，肠毒血症等单价苗，继之出现了羊猝狙、快疫二联苗，羊黑疫、快疫二联苗，快疫、羔羊痢疾、肠毒血症三联苗。文希喆等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、碎狙、肠毒血症、黑疫五联苗。纪金春等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、猝狙、肠毒血症、黑疫和肉毒中毒六联苗。 疫苗现状 上世纪70年代到80年代，中监所的文希喆、王泰健、屠伟英等科研人员，在国际上率先开创了梭菌多联干粉苗的研究，取得满意效果，保存期长，使用方便，可以随意搭配，疫苗的保护期也得到的延长，基本克服了液体苗的缺陷。 效力检验：多联苗所含的成份越多，需要的动物也越多，以致于达到不便检验的程度，严重阻碍了多联苗的发展， 采用免疫动物测定血清中和效价的方法，来评价梭菌苗的效力。其方法是用梭菌苗免疫动物两次后，用国际单位(I.U.)衡量血清的中和效价，检验每批疫苗所需试验动物为8-12只。 免疫效果与制苗菌液中毒素毒力正相关 抗原含量过大会产生严重局部反应，会导致安全性检验不合格 主要毒素 α毒素 各型产气荚膜梭菌均产生α毒素,它是产气荚膜梭菌最重要的毒素之一,同时又是A型产气荚膜梭菌的主要毒素 是A型产气荚膜梭菌的主要毒素。它具有磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)和鞘磷脂酶(Sphin-gomyelinase)两种酶活性,能水解细胞膜的主要成分膜磷脂,从而破坏细胞膜结构的完整性 理化性质和生物学特性 α毒素是由370个氨基酸组成的单链多肽,分子量为43 ku。它是一种依赖于锌离子的多功能性金属酶,具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性 当把α毒素加热至60~70℃时,就可以使其失去活性,当进一步加热到100℃时,又可以恢复部分活性 α毒素基因的克隆与表达 α毒素基因在禽类和哺乳动物中都是保守的 毒素的启动子是最强的启动子之一,可被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别,因而α毒素在自身启动子下不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达,也可在大肠杆菌中得到高效表达 免疫α毒素的C端功能区,来预防产气荚膜梭菌所致气性坏疽的发生 刘家森等克隆了α毒素基因序列中从第294个碱基到中止密码子约900 bp的核苷酸序列,并表达出大小约3. 8 ku的重组蛋白。重组蛋白完全涵盖了α毒素的羧基末端的蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端内对α毒素起重要作用的Trp1、His11、Asp56、His68等氨基酸残基;表达的重组蛋白含量占到菌体蛋白总量的30%以上,且表现出良好的反应原性,无毒性