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基因工程Gene Engineering
基因工程Gene Engineering 主讲人:王祎玲 Email:ylwangbj@ Phone概 述Introduction 重组DNA技术是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,是指按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新形状的DNA体外操作程序,也成为分子克隆技术。 因此,供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 二、基因工程诞生的理论基础 (1)肺炎双球菌转化实验 1944年 Avery,确定了基因的分子载体是DNA,而不是蛋白质。 1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。 3. 中心法则和遗传密码 1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则” 三、基因工程诞生的技术突破 * 第一节 基因工程的诞生 DNA重组技术的定义 一、基因工程的定义 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 基因工程的基本形式 第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程 第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途经工程 第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程 (2)噬菌体转染实验 1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。 1 . DNA是遗传物质 2.DNA双螺旋结构 1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码 DNA RNA protein 三、基因工程诞生的技术突破 1. 限制性内切酶(restriction enzymes) 1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。 Werner Arber 理论预见限制酶 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶 1978年Nobel生理或医学奖 2. DNA连接酶(ligase) 1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。 3. 载体(vector) 1972年前后使用小分子量的细菌质粒和?噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。 4. 感受态体系 1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。 5. 琼脂糖凝胶电泳 1960s发明了琼脂糖凝胶电泳,可将不同长度的DNA分离开。 6. DNA测序技术 1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术。 1980年Nobel化学奖 四、基因工程的诞生 1980年Nobel化学奖 1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组实验: 1. Berg的开创性实验 将SV40的DNA片断与?噬菌体的DNA片断连接起来。 (用DNA末端转移酶,而非限制性内切酶) 2. Boyer-Cohen实验 1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒,具有双重抗药性。 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组,转化大肠杆菌,并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。 Boyer- Cohen 实验 Stanley Cohen 1986 Nobel生理或医学奖 Herb Boyer 外源DNA在寄主细胞内可大量扩增,和高水平表达。 1. 跨物种性 2. 无性扩增 外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。 五、基因工程的特征 2. 重组体的制备 六、基因工程的主要操作内容 1. 目的基因的获取 从复杂的生物基因组中,经过酶切消化或PCR扩增等步骤,分离出带有目的基因的DNA片断。 将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记(抗菌素抗性)的载体分子上。
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