大血藤对破骨细胞活性与`成骨细胞增殖分化作用探讨.docVIP

大血藤对破骨细胞活性及成骨细胞增殖分化作用的研究 　　[摘要]该研究采用1α，25-（OH）2VitD3诱导兔骨髓细胞法获得破骨细胞，以形态学观察、HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色来鉴定破骨细胞，用TRAP+细胞计数、TRAP活力测定和骨吸收陷窝的数量及面积来检测大血藤对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响。培养MC3T3-E1Subclone14（小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14）细胞，用MTT法、碱性磷酸酶活力测定检测大血藤对其增殖和分化的影响。结果表明大血藤醇提物和水煎物低、中、高剂量组（2，20，200mgL-1）对破骨细胞分化及骨吸收功能具有抑制作用，并具有剂量依赖性。大血藤醇提物和水煎物低、中剂量组具有促进MC3T3-E1Subclone14细胞增殖分化的作用，说明大血藤对骨质疏松有一定的防治作用，这种作用可能是通过抑制破骨细胞活性和促进成骨细胞增殖分化来实现的 [关键词]大血藤；破骨细胞；成骨细胞；骨吸收；增殖分化 大血藤为木通科植物大血藤Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils.的干燥藤茎，味苦，性平，归大肠、肝经，具有清热解毒，活血，祛风止痛的作用，用于跌扑肿痛，风湿痹痛等[1]。关于骨质疏松的中医病因病机，各医家都有自己的论述。目前较为一致的观点是：骨质疏松的发生与肾、脾、瘀等都有关系，其中肾亏为主，脾虚为辅，血瘀是促进因素[2-3]。因此，中药防治骨质疏松症多从补益肝肾、强筋壮骨、益气养血、活血化瘀入手。大血藤为传统中药材，是一种强壮补血药[4]，可能具有抗骨质疏松方面的药理作用。本文旨在研究大血藤对破骨细胞活性和成骨细胞增殖及分化的作用，为抗骨质疏松药物的开发提供理论依据 1材料 1.1动物及细胞48h内新西兰大白兔，购自贵州省畜牧研究所实验基地，清洁级，合格证号SCXK（黔）2012-001；MC3T3-E1Subclone14小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14，购自中国科学院细胞库 1.2药物及样品的制备大血藤（四平市百草堂中药饮片有限公司，批产地四川）。取大血藤100g，用75%乙醇1000mL回流提取3次，时间分别为3，2，1h，过滤，合并提取液，经减压浓缩、冷冻干燥后，得到醇提物浸膏备用。取大血藤100g，用水1000mL煎3次，时间分别为2.5，2，1.5h，过滤，合并提取液，经减压浓缩、冷冻干燥后，得到水煎物浸膏备用 1.3试剂破骨细胞α-MEM培养基（Gibco公司，批号1532454）；成骨细胞α-MEM培养基（Gibco公司，批号1510464）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号140502）；青，链霉素（Solarbio公司，批；ToluidineBlue（Sigma公司，批号BCBG4799V）；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒（Sigma公司，批号SLBJ7300V）；抗酒石酸酸性磷酸酶（StrACP）测试盒（南京建成生物工程研究所，批；L-抗坏血酸（Sigma公司，批号A7506）；β-甘油磷酸钠（Sigma公司，批号G5422）；地塞米松（Sigma公司，批号D1756）；碱性磷酸酶（AKP）测试盒（南京建成生物工程研究所，批；BCA法蛋白定量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批；MTT（GENVIEW公司，批号46170204106）；Tritonx-100（MPBiomedicals，批号M2528） 1.4仪器RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；LGJ-12型冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；3111型CO2培养箱（Thermo）；BX51TF型正置研究型荧光显微镜（Olympus）；XD20-RFL型倒置荧光相差显微镜（宁波舜宇仪器有限公司）；1510型酶标仪（Thermo）；S-3400N型扫描电子显微镜（Hitachi） 2方法 2.1兔骨髓细胞的分离和诱导培养参照吕享等[5]的方法，将出生48h内的乳兔断颈处死，75%乙醇浸泡消毒，在无菌操作台中剥离后肢股骨和胫骨，置于冷的PBS中，用无菌纱布剥除软组织后，将骨干置于含α-MEM全培养基（含10%胎牛血清，青霉素100UmL-1，链霉素100gL-1）无菌培养皿内，然后用灭菌的手术剪刀将骨干纵向剪开，轻刮出骨内的细胞直至骨内表面变白，剪碎骨干合并含细胞培养基于具塞玻璃管中经漩涡震荡1min左右，过200目细胞筛后配成所需细胞悬液，按照1～2×106个/孔的密度接种于24孔培养板（0.5mL/孔）内，置于5%CO2，37℃饱和湿度条件下培养。24h左右用PBS洗掉未贴壁细胞，加入含1