EV71病毒C4亚型重组病毒样.pptVIP

EV71病毒C4亚型重组病毒样颗粒诱导的中和抗体抑制吸附前及吸附后的感染。 研究生：王新刚 导 师：孟继鸿教授 前言： EV71是小RNA病毒家族中的肠道病毒属，拥有大约7.4kb的单正链RNA，正二十面体衣壳。 病毒基因组 非结构基因P2和P3区 结构基因P1区 VP1、VP0、VP3。 VP2和VP4。 EV71是手足口病的病原体，手足口病发生于5岁以内的儿童，过去几年里，在远东地区如，中国、越南、韩国呈暴发流行，引起严重的发病率和死亡率。 感染EV71的个体常常显示轻微的症状，如在手、足及背臀部的水泡和发烧。一部分EV71感染者发展成严重的神经系统并发症，包括小儿麻痹症样瘫痪、脑干脑炎和肺水肿，最后导致死亡。 没有特异的疫苗能够用于阻止EV71的感染。 EV71分为三个基因型(A, B and C)，进一步分为11个基因亚型(A,B1–B5, and C1–C5)。 因此，理想的EV71疫苗能够阻止大部分基因型感染。 在所有研究EV71的疫苗中，病毒样颗粒(VLP)是最有前途的疫苗。在产量和安全方面都优于灭活疫苗。 Chung YC, Ho MS等用重组EV71病毒C2亚型病毒样颗粒能够在小鼠和猕猴中诱导产生高滴度的抗体。 用EV71VLP免疫的雌鼠能够通过被动免疫给予新生小鼠免受EV71致死性感染。证明中和抗体在免疫防御中起了重要作用。 然而，抗VLP抗血清在体外如何中和EV71病毒还不清楚。 现在的研究是： 用杆状病毒/昆虫细胞表达系统生产EV71病毒C4亚型的重组VLP。 评价VLP在小鼠体内诱导中和抗体的能力。 阐明抗VLP抗血清中和EV71的机制。 材料与方法： 一、细胞与病毒： 实验中用的RD 与 Vero 细胞（Ku Z, Shi J, Liu Q, Huang Z (2012) Development of murine monoclonal antibodies with potent neutralization effects on enterovirus 71.）， EV71 病毒C4亚型在RD细胞中增殖。根据Reed–Muench 的方法以TCID50在RD细胞上滴定其浓度。纯化，灭活的病毒有hualan（中国河南）获得。 二、衣壳亚单位蛋白特异性多克隆抗体 抗-VP0豚鼠多抗 抗-VP3多抗用与EV71有交叉反应的重组CAV16的VP3蛋白免疫豚鼠获得，用于检测EV71的VP3蛋白。 抗-VP1多抗用大肠杆菌表达的重组EV71的VP1蛋白免疫兔子产生。 三、载体构建 从感染EV71病毒C4亚型的RD细胞抽提病毒RNA，随后用脱氧核酸引物和M-MLV反转录酶进行反转录。用cDNA作模板，扩增编码P1与3CD基因片段。 P1片段的扩增 引物 (forward 5,–AATCCATGGGTTCGCAGGTGTCT-3, and reverse 5,- GACAAGCTTTCAAAGAGTAGTGATCGC-3,),用NcoI and HindIII酶切，然后插入到质粒pIExBac-1，成为pIExBac-P1 3CD 片段的扩增引物(forward 5,-AATCCATGGGCCCGAGCCTTGATTTT-3, and reverse 5,-GACAAGCTTTCAAAATAACTCGAGCC-3,), 用NcoI and HindIII酶切, 然后在同样位点插入到质粒pIExBac-1 成为pIExBac-3CD. Figure 1. Diagrams of the constructs used in this study. lef2, the left sequence for homologous recombination; hr5-Enh, AcNPV hr5 enhancer;IE1-P, IE1 immediate early promoter; p10-P, p10 promoter; IE1-T, IE1 terminator; 1629, the right sequence for homologous recombination. 四、重组杆状病毒的产生。 重组载体pIExBac-P1 和 pIExBac-3CD，经过转染，产生，选择和重组病毒的增殖。分别产生相应的重组病毒，也就是IExBac-P1 和 IExBac-3CD。Sf9细胞用重组杆状病毒感染，感染后72小时，收集感染的细胞和上清，用于分析