ELISA和ELISPOT检测技术.pptVIP

酶联免疫斑点试验（ELISPOT） ELISPOT技术简介 ELISPOT的基本原理 ELISPOT的实验方法 ELISPOT技术的应用 ELISPOT技术简介 酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) 随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时，以往常用ELISA方法检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的CK或循环抗体的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。 ELISPOT的发展概况 Sedgwich JD (澳大利亚)和Czerkinsky CC (瑞典)等人几乎同时在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。 底板材料的发展：普通塑料板(1983) 硝酸纤维素膜 (NC膜, 1985) 聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜) 透明板(1997, 荷兰U-Cytech公司) 抗体制备技术的发展：上世纪90年代后抗体制备技术提升。 检测内容的发展：由抗体检测向细胞因子检测。 发展趋势：1. 多种细胞因子在同一孔板中同时检测。 2. 试验操作的标准化、规范化。 ELISPOT的技术特点 灵敏度高：在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。是目前最为灵敏 的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级 。 单细胞水平，活细胞功能检测 ：检测的是单个活细胞分泌功能，而非细胞群体的 平均分泌功能。 操作简便经济，可以进行高通量筛选 ：没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样 品，效率远远高于其它检测方法 。 ELISPOT的基本原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与酶标记（例如碱性磷酸酶）的亲和素结合。底物（BCIP/NBT，产物为蓝紫色）孵育后，PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。 * * * * * * * ELISA与ELISPOT检测技术 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫斑点试验（ELISPOT） 酶联免疫吸附试验 (ELISA) ELISA技术简介 ELISA的基本原理 ELISA的类型和方法 ELISA方法注意事项和应用 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ： 基于抗原-抗体反应的特异性和等比例性，是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附（包被）在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板，也称酶标板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，加入相应的酶底物后发生颜色反应，通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，通过颜色反应的深浅检测标本中相应抗体或抗原含量的检测技术 。 ELISA的发展概况 自从Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（ELISA）以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。 随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。 目前，ELISA检测技术在科学研究、疾病诊断、检验检疫、环境监测等诸多领域广泛应用。 ELISA的基本原理 酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现