项目四pcr扩增目的基因---大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶基因glya.pptVIP

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 如何设计PCR反应体系？ PCR产物的保存 未纯化的PCR产物-20℃放上一周没有什么问题。 纯化后若以干粉状态可在-20℃保存好几个月，若溶于Tris可保存一两个月。注意不要用纯水溶解。 四.PCR引物设计及相关软件使用 （一）. 引物设计的基本原则 引物长度（primer length） 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 引物C+G含量与退火温度 (melting temperature) 引物5’端设计 1. 引物的长度 一般为15-30bp，常用的是18-27bp. 2. 引物二聚体及发夹结构 产生引物二聚体带会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行 3.引物的GC含量和复性温度 引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 退火温度55℃左右 退火温度+5~10 ℃ =Tm值 Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 4.引物5’端设计 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 （二）. Premier 5.0 引物设计软件简介 Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析 Primer Premier 5.0使用介绍(1) Load sequence 基本信息 引物设计界面 引物有哪些信誉好的足球投注网站选项设定 有哪些信誉好的足球投注网站结果 引物信息 引物编辑 引物编辑 (一) PCR基因扩增仪的类型 PCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪 PCR基因扩增仪的设计均按照DNA变性、复性和延伸三个环节以及温度均恒、传导快和升降温迅速等原则，结合传感技术、微电子技术和电子计算机等技术发展而成的自动化和智能化的仪器设备 1. 水浴式PCR基因扩增仪 　水浴式PCR基因扩增仪一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成，样品管分别浸于三个水浴槽中，完成变性、复性和延伸三个过程，反应管在每个槽中停留的时间和槽间移动通过微电脑及其控制的机械臂完成。 国内生产厂家有： 华美生物工程公司(ZW－1型) 北京新技术研究所（1109型） 天津第二医学院(TE－1型) 中科院遗传研究所（PCR－90A型） 上海复旦生物技术所（FR－800型）等。 2. 气流式PCR基因扩增仪 　气流式PCR仪主要由对流恒温箱（机壳）、热气源、冷气源、控制器等组成，将样品管置于对流恒温箱中，由控制器控制热空气枪、热辐射源和大功力风扇，以提供冷热空气，变换反应管的温度。 3. 金属模块式PCR基因扩增仪 上面分布数量不等的样品管孔，采用电阻加热、压缩机制冷、半导体调制温度或电子调制温度。 该机体积小，升降温速度快，样品基座温度准确、均一度高，自动化程度高，扩增程序容量较大，检测样品数目多，可用于普通0.5ml管，检测结果稳定可靠性高，是目前国内外生产和使用较为普遍的PCR基因扩增仪。 国内外生产厂家主要有： 美国PE公司（PT系列） MJ公司（PCT系列） Ericomp公司（TCX系列）等等， 珠海黑马医学仪器公司（Hema 480型） 西安康怡公司CY系列，南京桑利司（SL－1型） 军事医学科学院（JK－236B型） 中科院遗传研究所（PCR－90B型）等。 维护注意事项 (1) 注意本机的使用环境条件和电源； (2) 机盖开关要轻，以防损坏盖锁； (3) 严禁工作时打开机盖； (4) 定期用中性肥皂水清洗样品槽，严禁使用强碱、有机溶液和高浓度酒精擦洗； (5) 有故障时请有专业知识的维修人员或厂家技术人员维修。 PCR反应条件的选择？ PCR反应条件为温度、时间和循环次数 一般分为8步： 1、预变性：可用94～95℃，2～10min,一般用5min。 2、变性：一般用94℃，30s~2min,一般45s~1min。 3、退火：温度自定，30s~2min。 4、延伸：70～75℃，一般72℃，对于〈2kb,1min;2kb,每增加1kb加1min。 5、循环数