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体细胞核移植在家畜应用中的研究进展 学号：2008084530 姓名：吴小文 指导老师：邱龙新 【摘　要】本文通过动物的核移植转基因技术对动物的定向改造已达到提高动物的抗病性能和营养性能的研究的综述。主要涉及猪、牛等家畜，包括在遗传育种、胚胎方面的研究。以及目前核移植技术在这方面存在的问题等。 【关键词】核移植 转基因 体细胞 1 核移植的定义及历史 所谓细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为细胞核移植与体细胞核移植两种。1]。随着卵母细胞的体外培养巧、体外受精巧、体外培养技巧和胚胎移植技术等体外胚胎生产技术巧的发展与深入研究，哺乳动物核移植研究取得重大突破到目前为止，经过全世界科研人员的辛勤努力，这一技术取得了极大发展和进步，运用体细胞核移植技术已分别获得了体细胞核移植小鼠、大鼠劝、猫、兔、狗等，表明核移植技术的发展正在渗透到生活的各个领域，尤其是我国的转基因克隆牛技术水平达到国际前沿水平。 2 转基因和核移植 2.1 动物转基因技术 动物转基因技术包括：显微注射法、脂质体介导法、电转染法、胚胎干细胞法、病毒载体法、精子载体法以及核移植。 2.2 体细胞核移植和转基因的关系 利用基因工程技术将目的基因整合到动物体细胞染色体中，并将其作为供体核移植入受体去核卵母细胞，构成重建胚，然后将其植入假孕母体待其妊娠、分娩便可得到经定向遗传修饰的转基因克隆动物。这其实是体细胞核移植技术与转基因技术结合的产物。体细胞核移植技术路线所获得的转基因动物，其机体各组织细胞均源自于最初形成重构胚的体细胞核理论上来说由其所形成的转基因动物应该全身的各组织细胞都具有同供核细胞一样的基因型，而通过其他途径获得的转基因动物有时会出现嵌合基因型国外很早就有这方面的报道Lai等采用核移植技术生产出世界第一只绿色荧光蛋白转基因猪：张运海等利用体细胞核移植技术生产出表达绿色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎表明我国科学家已经具备采用体细胞核移植技术路线制作转基因猪的全部技术[2-4]。 2.3哺乳动物核移植技术程序示意图 3体细胞核移植技术在动物中的应用 3.1体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪提高遗传育种基础 体细胞核移植转基因动物制作路线是目前生产转基因家畜的最佳方法。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转基因猪研究可以为转基因家猪育种和人类异种器官移植研究奠定良好的基础[5]。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一种水母蛋白，由于该蛋白可以在特定波长紫外光的激发下发出绿色荧光，因此可以作为标记蛋白。步骤包括：体细胞采集和培养、转基因体细胞核移植、胚胎体外培养和绿色荧光蛋白表达检测、胚胎移植、妊娠诊断及饲养管理、转基因克隆猪表型和DNA鉴定。结果如下： 图 GFP 转基因体细胞核移植胚胎体外发育及绿色荧光蛋白表达结果 (a)--(f)示荧光显微镜下、1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、早期囊胚和扩展囊胚中GFP的表达：(a)-(f)普通光子显微镜下的对应照片，×40[6、7] 本研究在对绿色荧光蛋白转基因猪不同器官组织样进行蛋白DNA序列分析时却发现，内脏中除肾脏外，其余多数器官的组织细胞绿色荧光蛋白表达微弱，但所有组织除肌肉外染色体中都可检测到GFP基因序列。转基因动物的基因表达水平在不同组织之间有差异是比较正常的，很多转基因动物的检测都证明了这一点，但是通过核移植路线生产的转基因动物具有嵌合基因型还是首次发现，尤其是仅在肌肉组织中无目的基因。其具体的发生机制还有待进一步研究。相信对该现象的揭示会对细胞分化和转基因动物的遗传稳定性等问题具有重要意义。 3.2体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪 3.2.1表达载体pCAGGS-sFat1-Neo的构建 sFat-1基因和哺乳动物全身表达载体pCAGGS-sFat1-Neo由军事医学科学院生物工程研究所合成和构建。使用EcoRⅠ从T载体上切下sFat-1基因，克隆入pCAGGS-Neo的EcoRⅠ位点中，pCAGGS-sFat1-Neo表达载体中(图1)，sFat-1基因的转录由CAG启动子驱动，Neo抗性基因由pGK启动子驱动[9、10]。 3.2.2 供体细胞的转染和筛选 大白猪胎儿成纤维细胞系的建立：细胞培养液添加66μg/mL青霉素、100 μg/mL硫酸、链霉素,10%(体积比)胎牛血清的高糖→转染前将原代细胞接种至六孔板中→将线性化的载体pCAGGS-sFat1-Neo转染至大白猪胎儿成纤维细胞→经600μg/mLG418筛选6天→降低G418的浓