吉林大学实验课件-细胞生物学实验.pptVIP

细胞生物学基础实验 ——张桂荣 实验内容 （一）石蜡切片制作 （二）PAS反应 （三） Feulgen反应 （四）动物细胞融合 （五）植物组织培养 实验内容 （一）石蜡切片制作 （二）PAS反应 （三） Feulgen反应 （四）动物细胞融合 （五）植物组织培养 （一）石蜡切片的制备 实验目的 实验原理 实验用品 实验步骤 实验结果 实验目的 熟悉动物石蜡切片的制作过程。 掌握HE染色的基本原理和染色方法。 掌握番红-固绿对染法的基本原理和具体方法。 动物实验原理 石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。 植物实验原理 石蜡切片法也是在研究动植物细胞的形态结构等方面常用的制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片，又可以切成连续薄片，切片经染色，观察效果甚好。番红-固绿对染法，为植物制片上最普遍的一种二重染色法，其染色程序简单并能清晰地显示出细胞的结构。番红为碱性染料，能使细胞核及木质化的细胞壁染成红色；固绿为酸性染料，能使细胞质及纤维素的细胞壁染成绿色。 实验用品 1. 器材：切片刀，切片机，恒温箱，温台，熔蜡炉，蜡杯，酒精灯，蜡铲，展片台，解剖刀，解剖针，解剖剪，解剖盘，培养皿，吸管，镊子，单面刀片，台木，毛笔，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。 2. 药品：卡诺氏固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、埃利希苏木精染液， 1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，郝普特氏粘片剂，中性树胶。1%番红，1%固绿 3. 材料：鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织，大豆的根、茎、叶 实验步骤 取材 → 固定 → 洗涤 → 脱水 → 透明 → 浸蜡 → 包埋 → 切片 → 粘片 →脱蜡 → 染色 → 脱水 → 透明 → 封片 实验步骤（HE染色） 取材： 颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或小肠）。切取的组织块不宜太大，以便固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2~3mm厚。 ※注意事项： 取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化(搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构)。 切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 实验步骤（HE染色） 固定： 将切好的肝组织用生理盐水洗一下，立即投入卡诺固定液中固定，固定30~50min。 ※注意事项： 一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1~2次新液。 材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 实验步骤（HE染色） 洗涤： 材料经固定后，除乙醇外，组织中的固定液必须冲洗干净，尤其是含有重金属的固定液。因为残留在组织中的固定液，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定液的性质而定，固定液为水溶液的常用水洗涤，固定液含有乙醇的则用50%~70%乙醇冲洗。 实验步骤（HE染色） 脱水： 30%、50%、70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min，放入95%、100%各两次，每次20min。各种材料经固定与洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。 ※注意事项： 脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。 如需过夜，应停留在70%酒精中。 脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 脱水、