小鼠精原干细胞的分离纯化及初步鉴定.pdfVIP

Heilongjiang Joumal of Animal Reproducti on Vo 1. 22 NO .4 2014 小鼠精原干细胞的分离纯化及初步鉴定 王永彬，刘凤美，张军令， 李艳华，靳淑敏， 丁静静 ( 开封市畜产品质量监测检验中心，河南 开封 475000) 摘 要:用两步酶消化法对昆明白小鼠辛丸精原细胞及精原子细胞进行了体外分离、纯化和初 步鉴定。 经两步酶消化所获细胞悬液内活细胞、死细胞及细胞团的百分比分别为 97.03% 、 2.971毛和 2.95% ;平均每个辛九可获得4.53 X 105 个细胞。 Percoll 不连续密度析，皮离心初步纯 化后得到 4 个细胞带，精房、 细胞主要分布在40% - 50 %PercoU 梯皮间，得到的精原细胞密度为 3.20 X 106 /mL。 因此，采用两步酶消化，结合Percoll 不连续密度梯皮离心法分离的昆明白 个 小鼠精原细胞能满足体外培养的需要，还可以作为精原子细胞移植的研究材料。 关键词: 小鼠; 精原千细胞;分离;纯化 中图分类号; 5814 文献标识码; A 文章编号; 1005 -2739 (2014 )04 -0019 -04 对精原干细胞(spermatogonial stem ce]) , 10 d 的为宜。 SSCs) 的生理生化特性及其分裂增殖、分化、 本研究旨在探索获得足够数量和纯度的 运动、衰老、死亡等各项生命活动的调节机 小鼠精原细胞的方法，为精原干细胞的体外 制的深入研究，精子发生机理的进一步阐明 培养和l 移植提供研究材料。 以及精原干细胞异体、 异种移植技术的实际 1 材料与方法 ，都迫切需要找到一种可行的方法将其 应用 1. 1 试验动物 分离纯化，以期得到较高产量和纯度的有活 出生6 -8 d 的昆明白小鼠。 力的精原干细胞，用于体外培养。 1. 2 主要试剂 在小鼠辜丸中，大约 1 万个靠丸生殖细 胶原酶(C - 5138 ， 美国 Sigma 公司) 、 胞中才有2 - 3 个精原干细胞[ I l ，它的数量 膜蛋白酶(四303 - 1 G , Sigma - Aldrich 公 稀少妨碍了对其进一步的深入研究。 因此， 司)、台盼蓝(Tηpan Blu e , 16146 - 5G ， 美 获取大量高纯度的精原干细胞对研究其生物 国 Si♂na 公司 ) 、 Percoll (P - 1644 ， 美国 特征并进行有效操作是非常必要的。 随着 学 Sigma 公司)、 DMEM(， 美国 Gibco 2 出生后时间的增长，精原干细胞逐步分化形 公司)、无 Ca + 、 MgZ + 的 PBS ， 其余药品为 成各级生精细胞， 其数量及所占比例都会越 国产分析纯。 来越少，这样使得 SSCs 的分离纯化极为困 1. 3 主要仪器 难，故选择动物的出生天数应较小。 一般小 超净工作台 ( NUAlRE ) 、 低速离心机 鼠选用出生后 7 - 8 d ，大鼠选用出生后 9- (HETTICH MIKRO