间皮素RNAi重组慢病毒载体的构建和鉴定.docVIP

　　间皮素RNAi重组慢病毒载体的构建和鉴定 【摘要】 　　 目的： 针对间皮素（MSLN）构建RNAi重组慢病毒质粒并用慢病毒包装，探讨MSLN功能. 方法 ： 根据MSLN基因信息,用慢病毒质粒载体pRNATU6.2/Lenti构建了三个携带小干扰序列和一个阴性对照序列的重组质粒，转染OVCAR3细胞后，检测RNA干扰效率，选择干扰效率高的质粒载体进行慢病毒包装，并检测病毒滴度，用慢病毒感染细胞再次检测RNA干扰效率和对细胞粘附功能的 影响 . 结果： 测序结果证明四种质粒载体的插入序列完全正确. 脂质体转染重组慢病毒质粒pRNATsiRNA3的RNA干扰效率最高,为67.5%. 鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度为1×108 ifu/mL. pRNATsiRNA3慢病毒感染细胞的mRNA干扰效率为78%，pRNATsiRNA3慢病毒干扰组细胞粘附率为（15.1±1.3)%明显低于阴性对照组(33.4±8.2)%和空白对照组 (30.0±5.8)%，差异均有统计学意义 (P＜0.05). 结论： pRNATsiRNA3慢病毒的感染能显著抑制OVCAR3细胞MSLN表达以及粘附能力. MSLN RNAi重组慢病毒质粒载体的制备成功为进一步 研究 MSLN功能和用慢病毒进行基因 治疗 建立了一个良好的平台. 【关键词】 间皮素；慢病毒属；RNA干扰；卵巢肿瘤；细胞粘附 　　Construction and identification of a rebinant lentiviral vector of RNA interference of mesothelin gene edical University, Shijiazhuang 050011, China 【Abstract】 AIM: To construsct a rebinant lentivirus plasmid of RNA interference of mesothelin gene. METHODS: According to the GenBank information of mesothelin, three interfering sequence and a negative sequence id pRNATU 6.2/Lenti. OVCAR3 cell e PCR. The plasmid id mix.The titer of virus id id L. The interfering efficiency of lentivirus atrigel (15.1±1.3)% than control groups［(33.4±8.2)%,(30.0±5.8)%,(P＜0.05)］. CONCLUSION: Infection of pRNATsiRNA3 lentivirus significantly inhibits mesothelin expression and cell adhesion.The successful construction of lentivirus vector of RNA interference of mesothelin gene lays a foundation for further study of the function and gene therapy of mesothelin. 【Keyesothelin; lentivirus; RNA interference; ovarian neoplasms; cell adhesion 　　0引言 　　间皮素（mesothelin, MSLN）是一种近年发现的肿瘤相关抗原，通常仅表达在胸膜腔、腹膜腔和心包腔的间皮细胞，但在恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌等恶性肿瘤中过表达. MSLN可能是CA125的配子，两者共同参与细胞粘附，并且具有很高的亲和力，与卵巢癌的腹腔种植有关，并参与肿瘤转移［1］. 但迄今为止，有关MSLN功能研究的报道还很少见. 本研究旨在通过针对MSLN的RNA干扰(RNA interference RNAi)重组慢病毒载体的构建和慢病毒包装，以探讨MSLN的粘附功能和利用慢病毒进行基因治疗的可能性. 1材料和方法 1．1材料人卵巢浆液性囊腺癌细胞系OVCAR3由河北医科大学第四 医院 科研中心提供. 人胚肾293T细胞购自中科院细胞库. 慢病毒质粒pRNATU6.2/Lenti（美国Genscript公司）；质粒抽提试剂盒（美国Axygen公司，德国Qiagen公司）；转染试剂LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）；慢病毒包装试剂盒pPA