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细菌内毒素检查法(凝胶法) 天津华立达生物工程有限公司 2010年9月 细菌内毒素检查法(凝胶法) 1、热原 2、细菌内毒素 3、鲎试剂 4、细菌内毒素检查用水 5、细菌内毒素检查的程序 6、相关参数的计算 7、鲎试剂标示灵敏度的复核试验 8、干扰试验 9、检查法 1、热原 热原 热原是指临床上能引起哺乳动物发热反应的物质。 热原反应 医院临床在使用药品注射剂时，常有发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、休克、严重时导致死亡，这种症状称为热原反应。 热原分类 外毒素热原 外毒素是指某些病原菌生长繁殖过程中分泌到菌体外的一种代谢产物。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。 内毒素热原 2、细菌内毒素 定义 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。 毒性反应 发热反应、白细胞反应、内毒素休克 特性 标准内毒素与环境内毒素 标准内毒素 经人工精制并经生物效价测定的细菌内毒素,作为BET的参考标准品或对照品 标准内毒素分内毒素标准参考品(RSE)和内毒素工作标准品(CSE)两种 CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际） 环境内毒素 环境内毒素是天然的内毒素普遍存在于水、空气及各种原料中,成份除了脂多糖外还含有蛋白质、多糖和其它杂质,其两极活性不明显,致热性较弱。BET的对象是环境内毒素。 细菌内毒素检查 通常称使用鲎试剂来检测细菌内毒素的方法为细菌内毒素检查法。 其中包括两种方法：凝胶法和光度测定法。 1）供试品限值 安福隆水针，1ml：5MIU；药典要求内毒素限值L=10EU/5MIU 2）试剂的选择 LOGO 天津华立达生物工程有限公司 Page * Page * Page * Page * Page * 细菌内毒素与热原的关系 细菌内毒素是热原之一种 医药工业接受的观点是,内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原,在GMP条件下控制内毒素污染就等于控制热原污染。 致热性 耐热性 酸碱性 鲎反应性 分子极性 需要在250摄氏度干热30分钟才能彻底灭活 多糖链端有亲水性，脂肪链端具有疏水性，在水中呈不均匀分布 内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原刺激下丘脑体温调节中枢，使人体发热升温 能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶 与强酸强碱水解反应，可灭活内毒素 Page * Page * Page * Page * Page * 3、鲎试剂 鲎试剂的分类 根据鲎的种类分类： 美洲鲎试剂（LAL） 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL） 根据检查方法分类： 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂 根据鲎试剂的特异性分类： 普通鲎试剂 特异性鲎试剂 Page * 4、细菌内毒素检查用水（BET水） 2005年版药典要求，凝胶法BET水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET水内毒素含量应少于0.005EU/ml。 2010年版药典要求，细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml （用于凝胶法）或0.005EU/ml （用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。 美国药典要求的BET水是指与所使用的鲎 试剂不发生反应的灭菌注射用水或其它水。 Page * 5、细菌内毒素检查的程序 验证实验 灵敏度复核试验 干扰试验 检查法 凝胶限量试验 凝胶半定量试验 Page * 6、相关参数的计算 内毒素限值 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/M L为供试品的细菌内毒素限值； K为人每千克体重每小时可接受的最大内毒素剂量； M为人每千克体重每小时的最大供试品剂量。 安福隆成品内毒素限值为10EU/5MIU，原液内毒素限值为20EU/mg。 Page * 最大有效稀释倍数 指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1-MVD），在不超过此稀释倍数的浓度按下进行内毒素限值的检测。用以下公式计算： MVD=cL/λ C为供试品溶液的浓度， λ为鲎试剂的灵敏度。 Page * 7、鲎试剂标示灵敏度的复核试验 实验目的 验证实验室的条件是否满足BET实验的要求 验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求 验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET水等）是否满足BET实验的要求 Page * 操作步骤示意图 翻转180度，观察凝胶状况 稀释为2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素标准溶液(C溶液) 0.1mlTAL＋0.1mlCSE(RSE)，平