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实验二、根系活力的测定 ——a-萘胺氧化法 植物生物学实验(二) 植物生理学基础与综合实验 一、实验目的 了解根系活力的生理意义； 掌握a-萘胺氧化法 测定根系活力的原理与方法。 了解植物生理学实验设计中的一些注意事项。 二、实验原理 （一）植物根系的生理功能: 吸收：水分、无机盐、CO2。 输导 固着 合成 贮藏 根系吸收无机盐的过程： 部位：根尖，根毛区最活跃。 步骤 1，呼吸释放CO2； 2，形成H2CO3； 3，H+与HCO3 -吸附在根表面。 4，溶液中阴阳离子分别与HCO3 -、 H+交换。 5，吸收，进入根内部。 6，运输。 （二）根系活力的意义与测定方法 根系活力即根的生长情况和代谢水平。它直接影响植物地上部的生长和营养状况以及产量。 植物根系中的过氧化物酶能氧化α-萘胺，生成红色的α-羟基-1-萘胺，并沉淀于根表面，将根系染成红色。 一般来说根呼吸强度越大，即该酶的活力越强，对α-萘胺的氧化力也越强，染色也越深。 可以根据根系表面着色深浅，定性观察并判断根系活力大小，也可通过测定溶液中未被氧化的α-萘胺的量，以定量测定根系活力。 定性观察 根系表面红色越深，说明根系活力越强。 定量测定 剩余的α-萘胺在酸性环境中可与对氨基苯磺酸（sulfanil-amide）和亚硝酸盐作用生成稳定的红色偶氮染料。 定量测定 注意： OD510越大→α-萘胺剩余越多→根系活力越弱 反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。 三、实验材料与仪器设备 （一）实验材料 水稻(Oryza sativa L.)等水生植物的须根系。 （二）仪器与用品 分光光度计、天平、恒温培养箱、三角烧瓶、量筒、移液管、剪刀、玻棒。 （三）试剂 α-萘胺溶液：先用少量的95%酒精溶解，然后加水定容成。配制50 μg/mL、50 μg/mL溶液。 0.1 mol/L磷酸缓冲液，pH 7.0。 1%对氨基苯磺酸溶液：溶解于30%的醋酸溶液中。 0.01%亚硝酸钠溶液。 四、实验步骤 （一）定性观察： 处理： 挖取处于不同生长状态的须根系植株（如水稻、豌豆苗根系等）数株，洗净根部后再用滤纸吸去根上附着的水分。 2.观察 将植株根系浸入盛有25 μg/mL α-萘胺溶液并用黑纸包裹的容器中，静置24-36小时后观察根系着色情况。 比较不同植株根系活力大小，并与植物生长势比较，分析植物生长势与根系活力之间的关系。 （二）定量测定 取50 μg/mL 的α-萘胺溶液和0.1 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液各25 mL，置于三角瓶中，混匀。 称取根系2 g浸没于三角瓶中的溶液中。 同样地，取50 μg/mL的α-萘胺溶液和0.1 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液各25 mL，置于另一三角瓶中，混匀，不放根系作为对照。 2、实验初始值测定 5min后，分别从两瓶中各取2 mL溶液，按照步骤4作第一次测定。 记录OD（实验组）与OD0（对照组）。 3、实验终了值测定 将两三角瓶置于25℃恒温箱中避光保温60min后，各取2 mL ，按照步骤4作第二次测定。 记录 OD’（实验组）与OD’0（对照组）。 4、a-萘胺含量测定 取2 mL培养液加10 mL水混匀，再顺次加入1 mL对氨基苯磺酸溶液与1 mL亚硝酸钠溶液，混匀，观察溶液颜色变化，再定容至25 mL。 室温25min后，于510nm处测定吸光度（OD）值。 5．标准曲线制作： 以50 μg/mL的α-萘胺溶液为母液，配置40、30、20、10、5、0 μg/mL的溶液各10 mL。 各取2 mL，按照步骤4分别反应，并测定OD值。以OD值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制α-萘胺溶液的标准曲线。或者根据浓度与OD值关系直接计算回归方程。 6．换算浓度 分别查对标准曲线，或利用回归方程直接计算出实验组与对照组溶液实验前后对应的α-萘胺浓度（ C、C’与 C0、C’0 ）。 7．计算根系活力 根据实验结果计算不同植株根系对α-萘胺的生物氧化强度（mg α-萘胺/gFW·h），并与植物生长势比较，分析它们之间的关系。 ?-萘胺生物氧化强度= 48mL×（C-C′）-48mL×（C0-C0′） 2g×1h 五、思考题 为什么利用a-萘胺氧化法测定植物的根系活力时需要在5min后作第一次测定？ 测定根系活力时最好选择根的哪个部位？为什么？ 3. 简述分光光度计使用过