利用生物素-链霉亲和素进行骨髓间充质干细胞的表面标记探究.docVIP

利用生物素-链霉亲和素进行骨髓间充质干细胞的表面标记探究 　　间质干细胞，也称为多能间充质基质细胞，是具有自我更新和多向分化能力的细胞，它存在于几乎所有的器官和组织。间质干细胞可以根据实验或治疗的预期目的，从脂肪组织、脐血、骨骼和其他组织分离获得。间质干细胞分离方便、缺乏免疫原性，具有多分化性，这些特性为间质干细胞移植治疗的研究奠定了理论基础。干细胞治疗的效果受到多种因素的影响和限制，其中在体内条件下低植入(归巢)率是高效使用干细胞治疗的主要障碍。如何将干细胞有效地输送到靶器官是当前面临的一项巨大挑战。 　　探索引导干细胞到达靶器官或组织的途径以及提高干细胞归巢效率是现今干细胞研究的重点领域之一。目前白细胞向炎症部位的归巢研究已较全面。归巢是一个级联事件。最初，在靶组织，流动的细胞和血管内皮细胞之间产生能抵抗流体剪切力的黏附作用，这个过程是由循环细胞所表达的黏附分子配体和内皮细胞表面的黏附分子所介导，黏附作用使循环细胞在内皮细胞表面滚动进而栓停，下一步通常是趋化因子激活的整合素介导的黏附及牢固黏附，最后是外渗出血管。 　　骨髓间充质干细胞静脉输注后归巢比例相对较小，最低仅3%，最高才22%[6-8]。研究提示骨髓间充质干细胞在体外培养过程中其表面的黏附分子表达下调，这可能是其归巢能力低下的关键原因。 　　有研究报道磺化生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(BNHS)中的N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)与细胞表面游离的氨基进行共价结合后可提供链霉亲和素的结合位点，利用生物素-链霉亲和素反应体系可以将细胞黏附分子配体添加到细胞表面以提高干细胞的归巢率，这种化学方法进行细胞表面修改的步骤如下：首先用磺化生物素-N-羟基琥珀酰亚胺处理细胞并在细胞表面引入生物素;第2步，链霉亲合素结合细胞表面的生物素同时提供未结合的位点;第3步，生物素化的黏附分子配体唾液酸LewisX(sialyl-LewisX ，SleX)通过链霉亲合素未结合的位点被装备到细胞表面。作者以大鼠骨髓间充质干细胞为实验对象，以磺化生物素-N-羟基琥珀酰亚胺、生物素、链霉亲和素为材料，将黏附分子配体SLeX装备到骨髓间充质干细胞表面，制备了“化学工程细胞”，并证实了化学表面修改的效率及其对细胞生物学特性的影响。该方法为促进骨髓间充质干细胞归巢的体内实验奠定了研究基础，在国内尚未见报道，现报道如下。 　　1 材料和方法 Materials and methods 　　1.1 设计 细胞学体外观察。 　　1.2 时间及地点 于2013年4月至2014年3月在江西 　　省人民医院干细胞重点实验室完成。 　　1.3 材料 　　1.3.1 实验动物 2周龄的雄性SD大鼠12只，体质量约50 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，SPF/VAF级，许可证号SCXK(湘)2011-0003。1.3.2 主要试剂和仪器 F12-DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，大鼠骨髓间充质干细胞成骨培养基、大鼠骨髓间充质干细胞成脂培养基(美国Cyagen公司)，大鼠抗CD34、CD90、CD29、CD45(美国Abcam公司)，罗丹明-链酶亲和素(美国Thermo公司)，生物素化的唾液酸化路易斯抗原(美国Glycotech公司)，生物素(美国Sigma公司)，茜素红染液、油红O染液(武汉谷歌试剂公司)，荧光显微镜、倒置相差显微镜(德国Leica公司)，超净工作台(苏宁集团安泰公司)。 　　1.4 实验方法 　　1.4.1 骨髓间充质干细胞分离、体外扩增、鉴定 2周龄雄性SD大鼠脱臼处死，体积分数为75%乙醇浸泡5 min，迅速游离双侧后肢股骨和胫骨。用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基冲洗骨髓腔，反复吹打混匀后将冲洗液移入25 cm2细胞培养瓶中，于37 ℃、体积分数为5% CO2条件下培养，24 h后半量换液，48 h后全量换液。待第3代骨髓间充质干细胞培养到80%-90%汇合时，采用流式细胞术鉴定细胞表面标志物表达：胰酶消化细胞，37 ℃孵育2 min，以1倍胰酶体积的含体积分数为10%胎牛血清的培养液终止消化，培养瓶中液体转移至15 mL离心管，1 000 r/min离心5 min，小心弃上清。使用冰PBS重悬细胞，光学显微镜下细胞计数，调整细胞浓度至1times;1010 L-1。在流式上样管中加入49 mu;L上述细胞悬液和1 mu;L荧光标记的单克隆抗体(CD29、CD90、CD34、CD45)，37 ℃避光孵育30 min，离心去上清液，PBS清洗2次，加入500 mu;LPBS重悬细胞，振荡混匀后流式细胞仪上以PE或FITC激发，检测阳性细胞比率。 　　1.4.2