miR-320a 抑制结肠癌细胞增殖及肺转移作用的讨论.docVIP

miR-320a 抑制结肠癌细胞增殖及肺转移作用的讨论 　结肠癌是全世界人类主要致死性肿瘤疾病之一。其致死性高、预后差，肿瘤转移复发是致死的重要原因。目前结肠癌的治疗方法主要是手术结合化疗及放疗，但最终肿瘤会出现复发转移，故生物治疗可能成为治疗结肠癌的突破点。 　　微小RNAs(microRNAs)是生物体内一类内源性非编码的小核糖核酸，它们能与靶基因的mRNA 互补序列3prime;-UTR 结合， 通过降解及抑制靶基因的翻译而抑制靶基因表达。多数研究已发现miRNAs的异常表达常导致恶性疾病的发生、发展。近年来的研究发现，miRNAs 介导的转录后调控可以调控结肠癌的发生发展。2003 年，Michael 等人在结直肠癌中发现几种表达下调的miRNA，其中miR-320a较为活跃，Markowitz 等人研究发现在直肠癌中miR-320a 的表达量明显下调，可作为直肠癌早期诊断的标志物之一。最近一项临床研究报道miR-320a 的表达下调与结肠癌Ⅱ期患者的肺转移及预后不良相关。但目前miR-320a 在结肠癌疾病进展中的作用机制并未研究透彻。 　　在前期研究中，我们发现与对照细胞GES 细胞相比，miR-320a 在SW480、HT29、HCT116 细胞株及结肠癌组织中的表达水平下降， 并成功应用慢病毒稳定感染结肠癌细胞，构建稳定表达miR-320a 的结肠癌细胞。在本研究中， 我们进一步在体外实验中验证它对细胞增殖及细胞侵袭转移的作用， 验证miR-320a 的下游靶基因，并通过裸鼠尾静脉注射实验初步明确了其可能与肺转移程度的关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　结肠癌细胞系SW480、HCT116 及293T 细胞由我校肿瘤生物学国家重点实验室馈赠。RPMI 1640培养基、DMEM 培养基、胎牛血清购自Gibco 公司;Lv-miR320a 及Lv-Luc 慢病毒质粒由我校生化教研室馈赠，MTT 购自美国Sigma 公司;DMSO 购自美国Sigma 公司;Transwell 小室购自美国Millipore 公司;Matrigel 基质胶购自美国BD 公司;BALB/C 裸鼠购自我校实验动物中心; 双荧光素酶报告基因载体pGL3-Control Vector 和内参质粒pRL-TK 购自Promega 公司;miR-320a mimics、NC 对照、PLKO-beta;-catenin 质粒与PLKO-EGFP 对照质粒购自上海吉玛公司;Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System 购自ABI 公司，beta;-actin、beta;-catenin、MMP-2、MMP-9、Ecadherin、N-cadherin 和Vimentin 抗体均购自美国Santa cruze 公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养及感染、转染培养细胞(SW480 及HCT116)48h 后，更换新鲜培养基， 同时加入终浓度为8mu;g/ml 的Lv-miR320a及Lv-Luc 病毒液感染细胞。筛选4 周后得到稳定表达miR-320a 的SW480 及HCT116 结肠癌细胞亚株和表达阴性对照Lv-Luc 的细胞亚株。结肠癌细胞株用含10%胎牛血清和双抗的RPMI1640 培养基在37℃、5% CO2的培养箱中培养。按说明书用Lipofectamine 2000 将miR-320a mimics/NC 及pGL3-beta;-catenin 3prime;UTR/pGL3-mut-beta;-catenin 3prime;UTR 及pRL-TK 参照质粒及PLKO-beta;-catenin 质粒与PLKOEGFP对照质粒转染结肠癌细胞株。 　　1.2.2 MTT 实验 　　将每组细胞制成1times;104 个/ml 的单细胞悬液，按每孔200mu;l 接种于96 孔板， 每种细胞设6 个复孔，分别干预2、3、4、5、6d 后， 避光分别加入MTT 溶液(5mg/ml)20mu;l，37℃孵育箱孵育4h，弃去上清，加入150mu;l DMSO，摇床震荡10min，酶联免疫检测仪上选择490nm 波长测定各孔吸光度，计算平均值。 　　1.2.3 细胞侵袭实验 　　将Matrigel 基质胶于冰上融化后， 用RPMI1640 培养基稀释后加100mu;l 于transwell 小室的上室，37℃孵育4h 使Matrigel 胶凝固，将分组干预48h后的结肠癌细胞用胰酶消化， 含1%FBS 的RPMI1640 培养基重悬细胞， 按1times;105 个/ml 的浓度种入上室细胞200mu;l， 下室加入含20%FBS