HIV-1Rev蛋白和人DDX3解旋酶对HCVRNA复制产生的作用研究.docVIP

HIV-1Rev蛋白和人DDX3解旋酶对HCVRNA复制产生的作用研究 　　丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)和人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)的传播途径十分相似，约30%的HIV阳性患者合并HCV感染。在中国的静脉药瘾的HIV感染者中，HCV阳性率可高达90%。HCV患者合并感染HIV将加速丙型肝炎病程进展，同时降低抗HCV疗效。近年较多研究表明，对合并感染患者针对HIV进行严格的高效抗逆转录病毒治疗(highlyactiveantiretroviraltherapy，HAART)不能有效地改善这些情况，同时HCV病程加速也与CD4+T淋巴细胞数量下降无明显关联。我们前期的研究也证实，HIV合并感染可能导致患者体内HCV准种分布特征改变，但HCV载量及准种复杂度与CD4+T淋巴细胞数量无关。以上证据提示HIV对HCV的影响可能存在其他途径。有研究证实HCV、HIV可以共感染同一肝细胞，进而可能导致两种病毒在同一细胞内发生相互作用。HCV、HIV均为RNA病毒，而DDX3在人体细胞内与RNA的复制过程关系密切，已有研究证实DDX3可与HCVCore蛋白结合促进HCV的复制。同时发现HIV-1Rev蛋白可与DDX3结合在核膜上形成复合体从而导致细胞质内DDX3的水平下降，也有研究表明，Rev蛋白可以与HCV5#39;-UTR作用直接促进HCV的复制。但是尚未有研究证实Rev蛋白可以通过间接作用影响HCV的复制，或通过影响其他细胞代谢途径影响HCV的复制，也没有研究证实Rev蛋白和DDX3可以共同作用并对HCV的复制产生影响。 　　本实验通过分别构建HCVRNA复制细胞模型及表达DDX3、Rev+DDX3的HCVRNA复制细胞模型，研究Rev蛋白和DDX3对HCVRNA复制的影响。旨在为进一步深入研究Rev蛋白和DDX3是否通过共同作用，从而影响HCVRNA复制。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　Huh7肝癌细胞系和HCV复制模型pCDNA3.1-JFH1均为本实验室保存，Huh7细胞系生长于含10%灭活小牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、氨苄青霉素(100U/mL)、链霉素(100U/mL)和DMEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。实验中主要材料包括:真核过表达质粒pCDNA3.1(鼎国生物技术有限公司，北京)，各种工具酶、核酸标准分子量Marker以及蛋白质预染Marker(天根生化有限公司，北京)，去内毒素质粒大量提取试剂盒(Qiagen公司，德国)，质粒转染转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen公司，美国)，鼠抗Flag单克隆抗体(Sigma公司，美国)、兔抗人GAPDH单克隆抗体、小鼠抗人DDX3单克隆抗体、小鼠抗HIVRev单克隆抗体(Abcam公司，美国)，HRP标记的羊抗兔IgG二抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗(福州迈新公司中国)，qPCR引物由Invitrogen公司合成。 　　1.2方法 　　1.2.1含Rev、DDX3基因重组真核表达载体的构建查询NCBI获得Rev蛋白和DDX3的基因表达序列，并分别在其基因的5#39;端引入限制性酶切位点EcoRⅠ和增强表达的Kozak序列，3#39;端引入限制酶切位点XbaⅠ和便于Rev、DDX3表达检测的Flag标签蛋白(DYKDDDDK)编码序列，以及便于观察转染效率的mCherry和YFP序列。以上相关基因序列由深圳华大生物科技有限公司协助合成。进一步分别将各自基因序列插入真核过表达载体pCDNA3.1中命名为pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag。从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列，用VectorNTI软件进行PCR引物设计。载体pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry正向引物(5#39;-AGTCCAGTGTGGTGGAATTCGCCACCATGGAGCCAGTAGATCCTAG-3#39;)(含同源重组序列、EcoRⅠ酶切位点、Kozak序列，并含有目的基因5#39;端配对序列)，(5#39;-TAGTCCATGGTGGCGAATTCTTCTTTAGTTCCTGACTCCAATAC-3#39;)(含同源重组序列、EcoRⅠ酶切位点，并含有目的基因3#39;端配对序列)。载体pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag正向引物5#39;-ACGATGACGATAAGCTCGAGGCCACCATGAGTCATGTGGCAGTGG-3#39;(含同源重组序列、XhoⅠ酶切位点、Kozak序列，并含有目的基因5#39;端配对序