NaF对RAW264.7细胞活力的影响探究.docVIP

NaF对RAW264.7细胞活力的影响探究 全身暴露于过量氟（F）可导致骨稳态和牙釉质的发展受到干扰，过量氟引起的骨病变中，破骨性吸收占相当重要的位置，虽然过度破骨性吸收是氟骨症致残的一个重要因素，但对破骨细胞的活动研究很少。2012 年我们采用小鼠破骨细胞前体细胞 RAW264.7构建体外破骨细胞染氟模型，观察破骨细胞染氟过程中的细胞增殖和分泌特异产物基质金属蛋白酶9（ma-trix metalloproteinase-9，MMP-9）和组织蛋白酶 K(ca-thepsin K)表达的影响。 1 材料与方法 1.1 破骨细胞前体细胞 RAW264.7 的培养 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7（购自中国科学院细胞库)，用含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeccoprime;s modified Eagleprime;s medium，DMEM，Gibco，美国）培养液于 37℃、5% CO 培养箱中培养。每3天换液一次，细胞增殖至对数生长期后，用0.25%胰蛋白酶室温消化后计数备用。MMP-9和组织蛋白酶K纯化多克隆抗体购于北京博奥森公司。 1.2 破骨细胞的诱导分化及鉴定 ①抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色：RAW264.7细胞以2times;103个/孔接种于24孔板，培养24 h 后用含终质量浓度为 50 mu;g/L RANKL 和 50 mu;g/L小鼠重组巨噬细胞集落刺激因子 （macrophage colonystimulating factor，M-CSF）的 DMEM 诱导分化剂。分别于诱导后第一、三、五和七天行TRAP染色。镜下破骨细胞呈多核巨细胞，TRAP阳性表现为酒红色颗粒。②破骨细胞特异性基因检测：用免疫组织化学的方法测定诱导后的染氟细胞内基质金属蛋白酶9和组织蛋白酶K的表达，观察并用Image-Pro Express图像分析软件镜下扫描灰度。 1.3 接种细胞和分组小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 细胞浓度 5times;104个/ml接种24孔板，每孔加2 ml 培养基。按 NaF 浓度分组：对照组（NaF 浓度为0mg/L）占 6 孔/板；实验组每个 NaF 浓度（2 mg/L、10mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L）占 6 孔/板。按时间分组：对照组、实验组按时间分为24 h组、48 h组、72 h组，分别接种6块板。 1.4 细胞活力测定 甲基偶氮唑蓝（4，5-Dimethylthi-azol-2-yl-2, 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法测定生长抑制率。细胞悬液以5times;104个/ml浓度接种于96 孔板。每组设 3 个平行孔，并设空白对照。贴壁培养24 h后分别加入不同处理因素，并测定不同作用时间（24、48、72 h）和不同浓度F的吸光度d值。 1.5 统计学分析 采用 Spss 13.0 软件进行统计，方差齐的多组比较采用单因素变量多因素方差分析，检验水准：alpha;=0.05。 2 结 果 2.1 NaF 浓度对 RAW264.7 细胞活力的影响 空白组（NaF浓度为0 mg/L）与实验组（NaF浓度为2 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L）相比较，除NaF浓度为2 mg/L组与空白组比较差异无统计学意义（t=7.276，Pgt;0.05）外，其余各组平均值低于空白组，差异有统计学意义（t=6.74、7.32、11.87、15.93、24.38，均 Plt;0.05），表明 NaF 浓度对 RAW264.7 细胞活力有抑制作用。在受试后的48 h，各实验组与空白组比较，仅60 mg/L（t=13.14)和80 mg/L（t=15.01）组差异有统计学意义（Plt;0.01），其余各组与对照组（0.43plusmn;0.002 16）相比，差异无统计学意义（t=0.46，Pgt;0.05）。在受试后的72 h，与对照组（0.406 667plusmn;0.010 842）比较，仅80 mg/L组差异有统计学意义（t=6.25，Plt;0.01），其余各组与对照组相比，差异无统计学意义（t=1.76，Pgt;0.05），见表 1。 表1 实验组和空白组在3个时间点细胞活力的比较(x plusmn;s) 注：a. 与对照组比较，Plt;0.05；b. 与对照组比较，Plt;0.01。