miR-21慢病毒载体的构建研究.docVIP

miR-21慢病毒载体的构建研究 　　微小RNAs(miRNAs)是存在于真核生物中的由18～25个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA，其功能是参与基因转录后水平的调控，通过与靶mRNA的碱基配对，导致靶mRNA的降解或翻译抑制，从而进行基因表达的调控。研究证实miRNAs参与细胞的增殖与凋亡、器官发育、分化等重要生物学事件，发挥着巨大的调控作用。其中miR-21发现较早，存在相对广泛，全长22个核苷酸，位于17号染色体的TMEM49基因编码区域内。miR-21的靶基因包括PTEN、TPM1、PDCD4、TIMP3等，参与细胞增殖与凋亡的调控。为深入研究miR-21在疾病发生中的作用及作为治疗新靶点的潜能，2014年6-12月，本研究构建了miR-21的慢病毒表达载体系统，并成功感染骨髓间充质干细胞(MSCs)，获得稳定转染的MSCs细胞系，为进一步研究miR-21的生物学特性奠定实验基础。 　　1材料与方法 　　1.1试剂 　　慢病毒表达载体pLVX-shRNA2由Clontech公司提供(载体编号为:VT1457)，Lip2000脂质体转染试剂盒(Invitrogen公司)，限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ(NEB公司)，质粒提取试剂盒(Omega公司)，miR-21定量QPCR检测试剂盒(百奥迈科生物技术有限公司)，293FT细胞，Wistar大鼠MSCs及其完全培养基(广州赛业生物科技有限公司)。 　　1.2引物的设计与合成 　　根据大鼠miR-21序列(rno-miR-21-5p，MIMAT0000790，UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA)，结合pLVX-shRNA2质粒载体特点，并引入酶切位点，进行设计引物。序列如下:rno-miR-21正向引物:5#39;-CGGGATCCAGCCACTACCAAGGCATGTT-3#39;;rno-miR-21反向引物:5#39;-CGGAATTCAACCACGACTAGAGGCTGAC-3#39;。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 　　1.3PCR扩增 　　以含有rno-miR-21-5p序列的DNA为模板进行PCR反应。PCR扩增条件:94℃预变性5min，94℃变性20s，67℃退火20s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延长3min，4℃保存。将扩增片段用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，并回收得到的目的片段。 　　1.4慢病毒表达载体pLVX-shRNA2-rno-miR-21-5p的构建与鉴定 　　纯化后的PCR扩增产物经BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切后，再次纯化得到rno-miR-21-5p片段。pLVX-shRNA2空载体用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切后，回收线性化空载体。将线性化载体与纯化的PCR产物在T4DNA连接酶作用下置于16℃条件下连接过夜，转化E.coliDH5alpha;感受态细胞，均匀涂在含氨苄青霉素的LB平板上，置于37℃条件下培养过夜。挑取少许菌落溶于LB培养液中，取1mu;L为模板，进行PCR扩增。PCR扩增条件为:94℃预变性5min，94℃变性20s，60℃复性30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸6min。得到的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳法进行初步鉴定;培养阳性克隆，提取质粒，送上海英骏生物技术有限公司进行测序。 　　1.5miR-21慢病毒载体的包装与滴度测定 　　转染前消化293FT细胞，重悬后接种，细胞长满70%～80%时进行转染。转染时，制备质粒混合物，加入待转染293FT细胞中，轻轻摇动混匀，37℃孵育5h后弃掉培养基，PBS洗涤3次，再加入新鲜培养基，置37℃继续孵育至48h。收集病毒液，过滤后分装置于-80℃保存。取其中一管进行滴度测定。测定前1d，将NIH3T3细胞传代置于6孔板中，每孔105个/mLtimes;2mL。待细胞生长到大部分融合时，选2孔，分别更换为1mL含有10mu;L和100mu;L病毒上清的完全培养基，培养箱中温育4h，再加入不含病毒液的完全培养液3mL继续培养48h后，将细胞按1∶4传代。加入嘌呤霉素(puromycin，1.5mu;g/mL)进行筛选14d，结晶紫染色后计数克隆数。病毒滴度(CFU/mL)=克隆数/病毒原液体积(mL)times;稀释度。 　　1.6慢病毒载体pLVX-shRNA2-rno-miR-21-5p感染MSCs及miR-21表达的检测 　　将携带miR-21基因的慢病毒液以不同感染复数(MOI，分别为20和40)加入至MSCs培养液中，感染24～48h后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，计算感染效率，比