Calcein-AM-PI双染法与流式细胞术检测γδT细胞毒性结合.docVIP

Calcein-AM/PI双染法与流式细胞术检测γδT细胞毒性结合 　　gamma;delta;T 细胞是一群桥接固有免疫和适应性免疫的独特T 淋巴细胞亚群，约占外周淋巴细胞的0.5%~5%，在机体抗感染和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。最近研究发现，gamma;delta;T细胞在难治性前列腺癌、肾癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤、转移性黑色素瘤、白血病和淋巴瘤的临床治疗中总客观应答率达40%，其中难治性前列腺癌和肾癌的客观应答率优于二线化疗药。虽然取得了很好的临床效应，但缺乏一种准确、简单、经济的方法评估其杀伤效应，该方法的建立对推进免疫细胞临床应用标准化质量体系的建设具有重要意义。免疫细胞细胞毒活性经典的检测方法是51Cr释放法，由于放射性元素污染，极大地限制了该方法的应用。其它检测方法如MTT法、乳酸脱氢酶(LDH)释放法，存在灵敏度不高、操作繁琐的缺点。最近研究发现，用钙黄绿素-AM(Calcein-AM)染色效应细胞，检测前用碘化丙啶(propidium iodide，PI)对死亡细胞染色，最后用流式细胞仪(flow cytometry，FCM)检测，具有与51Cr 释放法相当的准确性。然而经典方法无法区分死亡细胞的来源：即来源于免疫细胞介导的杀伤还是自然死亡。因此我们通过实验，建立并优化了Calcein-AM/PI 双标法结合流式细胞术检测gamma;delta;T细胞杀伤性的方法，解决了上述方法的不足。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂和仪器 　　Calcein-AM 购自Invitrogen，PI、HMBPP 购自Sigma，RPMI 1640、胎牛血清(FBS)购自Gibco，重组人IL-2(rhIL-2)购自北京双鹭，硫酸庆大霉素购自宜昌人福药业，人淋巴细胞分离液购自天津灏洋。抗CD3-FITC、抗CD3- PerCP、抗CD4-PE、抗CD8-PE、抗TCRVgamma;9-PE 荧光抗体和Trucount管购自BD。流式细胞仪FACSCanto II和Z2全自动细胞分析计数仪分别购自BD和Beckman。 　　1.2 标本来源和gamma;delta;T细胞培养 　　采集健康成年志愿者外周静脉血，肝素抗凝，生理盐水等体积稀释后，Ficoll 密度梯度离心法分离获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs);充分洗涤后调整细胞数为1times;106/ml，重悬于含5% FBS、5%人自体血浆和80 IU/ml硫酸庆大霉素的RPMI 1640完全培养基中。接种于T25培养瓶，每瓶5 ml，同时加入HMBPP和rhIL-2，终质量浓度均为20 ng/ml，根据细胞生长情况每2~3天进行补液或传代，补液使用含有300 IU/ml rhIL-2的RPMI 1640完全培养基，补液后细胞数维持在(0.5~1)times;106 /ml，培养至7~10 d收集细胞，经上述条件处理可获得gamma;delta;T细胞。肿瘤细胞株K562 和A549 均购自中国科学院上海细胞库，用含有10% FBS的RPMI 1640培养基于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。 　　1.3 Calcein-AM 标记靶细胞Calcein-AM 以二甲基亚砜(DMSO)配制成储存液(2 mmol/L)，分装后-20 ℃ 保存。不同的肿瘤细胞有不同的染色条件，为了确定染色条件，取对数生长期的K562、A549细胞，PBS洗涤2 次后调整细胞数为4times;106/ml，添加于24孔板，每孔1 ml;将倍比稀释的Calcein-AM加入上述细胞孔，终浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.0 625、0.0 313、0.0 156、0.0 078 mu;mol/L，每一梯度设3个复孔，然后于37 ℃、5% CO2培养箱内孵育30 min;孵育结束后，用含10% FBS的RPMI 1640培养基洗涤2次，制备成1times;105/ml细胞悬液，分别于0、4和24 h上机检测MFI值。固定Calcein-AM浓度为0.5 mu;mol/L，调整细胞数分别为5times;104/ml、1times;105/ml、2times;105/ml、4times;105/ml、8times;105/ml、1.6times;106/ml、3.2times;106/ml、6.4times;106 /ml、1.28times;107/ml，然后按照上述步骤进行染色、洗涤和检测MFI值。 　　1.4 细胞收集、PI 染色和流式检测标准操作程序将Calcein-AM 标记好的肿瘤细胞与gamma;delta;T细胞按1∶10的比例