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FLAER多参数检测PNH克隆的影响 　　阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种获得性克隆性造血干细胞疾病，其发病机制主要是由于体细胞X染色体上的PIG-A基因突变，导致血细胞膜表面糖化磷脂酰肌醇(GPI)锚合成障碍，锚连接蛋白缺失。传统的诊断方法主要有蔗糖溶血试验、酸溶血试验、尿含铁血黄素试验，但这些方法敏感性、特异性差。近些年来，通过流式细胞仪检测CD55、CD59已经成为诊断PNH的常规方法，特别是CD59，其敏感性高于CD55，在PNH 诊断过程中被认为是一个优于CD55 的指标。荧光标记的无活性嗜水气单胞菌溶素前体的变异体(FLAER)可以特异性的与GPI锚连蛋白结合，经流式细胞仪检测，其特异性和敏感性较传统方法更好。PNH、再生障碍性贫血(AA)和骨髓增生异常综合征(MDS)均为骨髓衰竭性疾病，具有相似的发病机制和临床表现，早期鉴别诊断常很困难。本文联合FLAER、CD45、CD15、CD24 多参数检测粒细胞PNH克隆以及CD59检测红细胞PNH 克隆，旨在有效提高PNH克隆检测的敏感性、特异性，有助于骨髓衰竭性疾病的早期鉴别诊断，现报道如下。 　　1　资料与方法 　　1.1　一般资料　所有病例均来自于本院血液科连续48例住院患者。其中PNH患者9例，AA患者13例，诊断均符合血液病诊断及疗效标准;MDS患者11例，符合2008年WHO诊断分型标准。对照组15例均为巨幼细胞性贫血患者。 　　1.2　仪器与试剂　FACSAria型流式细胞仪，溶血素、磷酸盐缓冲液(PBS)和CD59、CD45、CD15、CD24试剂和均购自BD公司，FLAER试剂购自加拿大Protox　Biotech公司。 　　1.3　方法 　　1.3.1　外周血红细胞CD59检测　取EDTA 抗凝全血100mu;L，经PBS洗涤后稀释于1.5mL的PBS中，取100mu;L加入CD59-PE单抗20mu;L，4℃避光孵育30min后，1　000r/min离心5min，弃上清，用2mL　PBS液洗涤2遍，重悬于1mL　PBS液中上机检测，用流式细胞仪测定CD59细胞的表达率。 　　1.3.2　外周血粒细胞FLAER检测　取EDTA抗凝全血100mu;L，加入CD45、CD15、CD24、FlAER抗体各20mu;L，避光孵育30min后，加入2mL溶血素，室温下避光10min，溶血完全后1　000r/min离心5min，弃上清，用2mL　PBS液洗涤2遍，重新悬于500mu;L的PBS液中液上机检测，用流式细胞仪测定FLAER的表达率。 　　1.4　统计学处理　采用SPSS17.0软件进行数据分析，计量资料以xplusmn;s表示，组间比较采用t检验和Mann-Whitney　U 检验，Plt;0.05为差异有统计学意义。 　　2　结果 　　2.1　临床特征　PNH患者9例，男6例、女3例，年龄16～60岁，中位年龄30岁;AA患者13例，男5例、女8例，年龄7～63岁，中位年龄38;MDS患者11例，男5例、女6例，年龄41～72岁，中位年龄53岁，其中RCMD　1例，RCUD　6例，RAEB-Ⅰ2例RAEB-Ⅱ1例，5q-综合征1例;对照组15例，男6例、女9例，年龄19～61岁，中位年龄34岁。 　　2.2　不同方法对PNH 患者检测的比较　PNH 组患者FLAER缺失率和CD59缺失率分别为(70.07plusmn;28.77)%和(38.51plusmn;29.15)%，显著高于对照组、AA组、MDS组，差异有统计学意义(Plt;0.05)。FLAER检测结果明显高于CD59检测，差异有统计学意义(Plt;0.05)。其中，有2例患者，一例CD59缺失率为7.8%，FLAER缺失率为88.1%;另一例CD59缺失率为5.5%，FLAER缺失率为23.2%。 　　2.3　不同方法对非PNH 患者检测的比较　各组中FLAER缺失率平均值均大于CD59缺失率，但差异无统计学意义(Pgt;0.05)，表明在非PNH组中FLAER和CD59检测无显著差异。对照组中FLAER缺失率为0.0%，特异性100%，有3例存在CD59缺失，缺失率均小于1%。13例AA 患者中5例检测出FLAER缺失，其中4例检测出CD59缺失，1例未检测出;11例MDS患者中3例检测出FLAER缺失，其中2例存在CD59缺失，1例CD59缺失率为0。结果说明FLAER检测比CD59检测更为敏感，特异性更好。 　　3　讨论 　　到目前为止，已经发现了20多种蛋白在PNH 患者血细胞表面表达缺乏，其中红细胞膜上衰变加速因子(CD55)和反应性溶血膜抑制物(CD59)