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FTA-巢式PCR方法鉴定溶组织 　　内阿米巴原虫的初步研究 　　阿米巴肠病是由于溶组织阿米巴(Entamoebahistolytica，E.h)寄生于结肠内，引起阿米巴痢疾或阿米巴结肠炎一种人兽共患寄生虫病[1]。该病分布范围广，易感机体较多，呈世界性流行传播。全球每年约有5千万人感染，因阿米巴肠炎和阿米巴肝脓肿(amoebic　liver　abscess，ALA)而死亡的人数高达10万[1-2]，其病死率在原虫寄生虫病感染中仅次于疟疾[3]。E.h原虫在人体内以滋养体和包囊两种形式存在，人感染后既可出现严重的侵袭性症状，也可处于无症状的带虫状态。 　　检测E.h 原虫常用的方法有直接涂片法和碘液染色法。但肠内除了E.h外，还有非致病性的阿米巴---迪斯帕内阿米巴(E.dispar，E.d)，其形态与E.h高度相似，镜检方法难以区分，且E.d 的感染率是E.h的9倍[4-6]。随着分子生物学的发展，明确了E.h和E.d 核酸序列的差别，通过PCR的方法可以将两者区分开来，为阿米巴原虫的生物鉴定提供了新的途径[7-9]。本研究在形态学鉴定(直接涂片、碘液染色)的基础上，拟建立一种快速、敏感的FTA-巢式PCR检测用于鉴定致病性的E.h。 　　1　材料与方法 　　1.1　材料 　　1.1.1　腹泻病人粪便样本　中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所健康教育咨询检测中心门诊腹泻病人新鲜粪便，一般取有黏液、血液部位进行收集检查。 　　1.1.2　主要试剂　0.9% 生理盐水，2.5%碘液，E.h基因组DNA由复旦大学医学院程训佳教授惠赠。FTA卡和FTA卡纯化试剂(英国Whatman公司)，TE　Buffer(生工生物工程上海股份有限公司)，TaKaRa　Ex　Taq酶(宝生物工程大连有限公司)，DNA　Marker(天根生化科技北京有限公司)，TBEBuffer(生工生物工程上海股份有限公司)。 　　1.2　方法 　　1.2.1　光学显微镜检查　直接涂片法：加1-2滴生理盐水于洁净的载玻片中央，挑取腹泻病人粪便标本中的可疑部分，在生理盐水中涂抹成粪便薄膜，厚度以透过粪便薄膜能看清字为宜，加盖玻片后显微镜下观察。 　　碘液染色法：用碘液代替生理盐水，制片方法同直接涂片法，检测是否存在阿米巴原虫的包囊或滋养体。 　　1.2.2　FTA卡提取DNA　将镜检结果为阳性的腹泻病人粪便分装于1.5mL离心管中，95℃水浴加热5min，冷却至室温后滴加于FTA 卡上，室温干燥。用打孔器从样品卡上取直径6mm 的小圆片，将其放入1.5mL 的离心管中，加入400mu;LFTA卡纯化试剂洗2次，每次浸泡5min。再用TEBuffer洗3次，每次浸泡5min，将处理后的小圆片于室温或56℃晾干。干燥后的FTA 卡小圆片可保存于室温。 　　1.2.3　巢式PCR扩增及分析　根据E.h的SSUrRNA序列设计巢式PCR 引物[10-11]，外引物分别为： E1 (上游引物)5prime;-TGCTGTGATTAAAACGCT-3prime;，E2 (下游引物)5prime;-TTAACTATTTCAATCTCGG-3prime;，预期扩增片段大小为1　076bp。E.h特异性的内引物的序列分别为：Eh-L(上游引物)5prime;-ACATTTTGAAGACTTTATGTAAGTA-3prime;， Eh-R (下游引物) 5prime;-CAGATCTAGAAACAATGCTTCTCT-3prime;，预期扩增片段大小为427bp。引物均由上海立菲生物技术有限公司合成。 　　第1轮PCR反应以处理好的FTA卡小圆片剪碎作为模板，加入10times;Buffer　10mu;L，25mmol/L的MgCl28mu;L，dNTP　Mixture(各2.5mmol/L)8mu;L，10mu;mol/L的引物(E1、E2)各4mu;L，Ex　TaqDNA聚合酶0.5mu;L，ddH2O 补足100mu;L。反应条件为：94℃预变性5min，94 ℃变性1min，47 ℃退火1.5min，72℃延伸2.5min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。 　　第2轮PCR反应以第一轮PCR产物5mu;L为模板，加入10times;Buffer　5mu;L，25mmol/L的MgCl24mu;L，dNTP　Mixture (各2.5mmol/L)4 mu;L，10mu;mol/L的引物(Eh-L、Eh-R、Ed-L、ED-R)各1mu;L，Ex　TaqDNA 聚合酶0.25mu;L，ddH2O 补足50mu;L。退火温度为58℃，其余反应条件与第一轮PCR 相同。阳性对照模板采用E.h 的基因组DNA，同时设