FILIP-1L蛋白的原核表达及多克隆抗体制备.docVIP

FILIP-1L蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 　　肿瘤细胞的迁移性与肿瘤侵袭、转移相关，肿瘤转移是肿瘤患者死亡的重要原因，因此肿瘤侵袭及迁移的机制研究与临床肿瘤治疗策略的发展密切相关。FILIP-1L(FilaminAinteractingprotein1-like，FILIP-1L;previouslyknownasdown-regulatedinovariancancer1，DOC1)是在卵巢癌细胞系低表达蛋白，其功能尚不完全清楚，研究发现FILIP-1L与乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤的侵袭负相关我们前期研究还发现FILIP-1L与热休克转录因子1(Heatshockfactor1，Hsf1)的降解有关，为了进一步研究FILIP-1L的生物学作用，我们构建了pGEX-4T3-FILIP-1L表达载体，应用FILIP-1L融合蛋白免疫新西兰大耳白兔，制备FILIP-1L多克隆抗体，为FILIP-1L生物学功能的深入研究提供有用工具。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　pGEX-4T3、pGEX-4T3-FILIP-1L(288)、pGEX-4T3-FILIP-1L(893)、PcDNA3-FLAG-FILIP-1L(893)及E.coliBL21，本实验室保存。新西兰大耳白兔购自河南省实验动物中心。肝癌细胞系HepG2、smmc-7721、bel-7402、plc/prf/5及肝永生化细胞changliver购于中国医学科学院上海细胞生物研究所。GlutathionSepharse4B购自GEHealthcareBio-SciencesAB。L-GluthionReduced为SCIENTIFICRESEARCHSRECIAL产品。Freund#39;，sAdjuantComplete及Freund#39;，sAdjuantIncomplete购于Sigma。ActiveEsterAgrose购自Bio-Rad。ProteaseInhibitorCocktail购自Sigma。辣根过氧化酶标记抗兔IgG为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。 　　1.2方法 　　1.2.1GST-FILIP-1L蛋白诱导表达分别将pGEX-4T3、pGEX-4T3-FILIP-1L(288)质粒转化E.coliBL21感受态细菌。挑取单个菌落接种于1mlLB培养基中，37℃振荡培养14h，按照1∶100的体积接种培养于新鲜LB液体培养基中，37℃180r/min振荡培养至A600约为0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导培养6h。取200mu;l菌液加入5times;LoadingBuffer50mu;l，沸水浴8min;另取6ml菌液，4000r/min，4℃离心10min。弃上清，加200mu;lPBS重悬沉淀，再加入5times;LoadingBuffer50mu;l，沸水浴8min。将菌液与细菌裂解液进行SDS蛋白电泳，考马斯亮蓝染色，观察GST-FILIP-1L蛋白表达。 　　1.2.2GST-FILIP-1L蛋白溶解性分析如上方法将pGEX-4T3-FILIP-1L质粒转染E.coliBL21，LB液体培养基中扩大培养，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导培养6h，4000r/min，4℃离心10min，PBS洗涤菌体沉淀2次，重悬沉淀，加入溶菌酶，冰上超声破碎，加1%TritonX-100，冰上放置30min，4℃，10000r/min，离心10min，分别收集上清和沉淀，进行10%SDS蛋白电泳。 　　1.2.3提取GST-FILIP-1L蛋白如上方法收集菌液，10000r/min，4℃离心10min，弃上清。沉淀中加入浓度为8mol/L的尿素溶液20ml，混合均匀，置冰上超声30s，间隔30s，共6个循环。9000r/min，4℃离心10min，收集上清于透析袋内，将透析袋置入2mol/L尿素溶液中，4℃透析过夜。将透析液更换为1times;PBS，4℃透析24h，期间更换PBS液一次。收集透析袋内液体，9000r/min，4℃离心20min，收集上清GST-FILIP-1L蛋白溶液备用。 　　1.2.4纯化GST-FILIP-1L蛋白取GlutathionSepharse4B2ml加入PBS溶液5ml，混匀，4000r/min，4℃离心5min，弃上清。重复上述操作三次，加入1mlPBS溶液悬浮beads。将GlutathionSepharse4B悬液与上述收集的GST-FILIP-1L蛋白溶液混合，置4℃旋转过夜。加预冷PBS液10ml，混悬，洗涤GlutathionSepharse4B，4000r/min，4℃离心5min，重复操作