第四章 抗体制药123节28527幻灯片.pptVIP

动物体内诱生法大量制备单克隆抗体 用BALB/c小鼠 降植烷 腹腔 杂交瘤细胞 (0.5 mL) (1X106) 取腹水 离心 上清。 接种后7-12d抽取腹水，抽取几次可达10mL。 六、单克隆抗体的纯化 依单抗Ig类和亚类不同；用途不同应选用不同的纯化方法。 用于体外诊断试剂的话，IgG类抗体应采用沉淀处理结合亲和层析的方法，IgM类抗体应采用沉淀处理结合凝胶过滤的方法。若制备体内诊断试剂或治疗用药则应注意去除内毒素、病毒、核酸等微量的污染物，必须经亲和层析和阴离于交换层析处理。 动物体内诱生法制备的单克隆抗体具体纯化方法及一般过程： 1、离心 取上清，超滤，盐析。 2、分离（纯化） ⑴凝胶过滤：用于IgG和IgM单抗的分离纯化。⑵阴离子交换层析：IgG单抗纯化。⑶蛋白A亲和层析：IgG单抗的纯化。 第三节 鼠源性单克隆抗体的改造 杂交瘤单抗为鼠源性，应用于人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。需要对鼠源性的单抗进行基因加工和改造，使其发挥作用和增加治疗效果。 目的：降低免疫源性；降低相对分子质量，增加组织通透性。 如：人-鼠嵌合抗体、改形抗体 、小分子抗体等人源化单抗。 抗体单拷贝或IgG结构图 鼠抗体可变区中关键氨基酸的分布 一、人-鼠嵌合抗体 抗原抗体结合功能决定于抗体V区，同种性免疫原性则决定于抗体C区。 在基因水平上将鼠源单抗的H 和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H 和L链的C区基因连接成人-鼠嵌合抗体的H 和L链基因，再转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的人-鼠嵌合抗体。 它保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性，但对人的免疫原性大幅度下降了。 二、改形抗体（CDR移植抗体） ΔIg分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。 Δ用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。这种改形抗体又称CDR移植抗体。 Δ模板替换、表面重塑、补偿变换、定位保留 三、小分子抗体 基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的V区片段，相对分子质量为原抗体的1/80～1/3。即保留CDR区，而Ig分子中的C区不表达。 小分子抗体类型有： 　①Fab抗体；②FV抗体 ③单链抗体(VH - VL)； ④单域抗体（VH or VL） ⑤最小识别单位(单个CDR) 　 ☆单链抗体基因构建的一般方法 ☆从杂交瘤细胞提取mRNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增抗体VH和VL基因，人工合成一条寡核苷酸序列(称Linker序列)，将VL的C端与VH的N端或VH的C端与VL的N端相连接，构建成单链抗体基因。 单链抗体的优点： ①可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象的背景更加清晰。 ②易渗透肿瘤组织中，增加药物治疗浓度。 ③免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应，延长在人体内的半衰期。 单链抗体大多在大肠杆菌中表达，有三种形式： 　①直接在细胞质中表达； 　②与其它菌体融合表达融合蛋白； 　③分泌表达具有功能的单链抗体。 通过单链抗体的C末端连接另外单链抗体基因，构建和表达双特异单链抗体，可应用于肿瘤的诊断和治疗。它还可与IL—2、TNF等细胞因子基因连接，使细胞因子能特异性杀伤肿瘤细胞，增强抗肿瘤活性，降低其毒副作用。 四、双功能抗体 双功能抗体就是双特性抗体。它是一种非天然性抗体。其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。 构建方法： ⒈化学交联法（双功能试剂SPDP） ⒉生物学方法（杂种-杂交瘤） ⒊基因工程法 双功能抗体一个臂识别肿瘤细胞表面抗原，包括肿瘤相关抗原、癌基因产物、特殊的白细胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特异性受体等，并实施有效的结合，而另一个臂可识别免疫效应细胞及分子，如CD3、毒素、药物等，介导T淋巴细胞、LAK细胞或毒素与药物发挥细胞毒作用。 双功能抗体在治疗肿瘤、自身免疫病、病毒性疾病中将会产生巨大的应用价值。 五、抗体融合蛋白 抗体融合蛋白广义属双功能抗体。 类型： ①配基-配基型融合蛋白； ②配基-Ig型嵌合蛋白；(较为成熟) ③配基-FV型融合蛋白； ④受体-FV型融合蛋白； ⑤酶-抗体型融合蛋白。 当抗体和酶的融合蛋白定位在肿瘤部位后再给予前体药物，其优点是提高肿瘤区域的药物浓度，降低对正常细胞的毒性。该方法可使药物浓度在肿瘤部位提高10倍，而在正常组织中降低2—3倍。 构建抗体融合蛋白的基本原则： ※将第一个蛋白的终止密