一种新的检测谷类植物中的叶酸的微生物检测方法.docVIP

AOAC 官方方法： 一种新的检测谷类植物中的叶酸的微生物检测方法 注意事项：详情见实验室安全附录B： 操作时小心氢氧化铵； 操作时小心盐酸； 操作时小心具有高度腐蚀性的氢氧化钠和氢氧化钾，能够引起严重的烧伤，注意保护皮肤和眼睛； 易燃气体：在操作热水、蒸汽或者进行电炉加热的时候要在适当的安全防护下进行操作；实验过程中要使用有效的除烟装置去除易燃蒸汽。特别要在开始加热前加入沸芯，在长颈烧瓶中预留足够的空间；除非蒸汽处于密封状态，要不所有控制系统必须位于控制区外； 有毒液体：必须用有效的烟清除系统及时去除蒸汽；避免蒸汽接触到皮肤。 本方法运用活的干酪乳杆菌ATCC 7469（organism Lactobacillus casei subspecies rhamnosus（鼠李糖）-ATCC 7469？？？不知道该如何翻译。推测是不是该菌偏好鼠李糖的一个亚种？？？） 来测定食物中的叶酸总含量和维生素浓度。该方法也可以通过运用自动稀释系统、浊度测定仪或96微孔板读数系统实现半自动化。值得注意的是：叶酸对光线和氧气均十分敏感。在操作时推荐使用黄光和低光化学玻璃器皿。将所有的样品均在较弱的光线下储存。 A．使用原则：食物，掺水，经过高压灭菌后分解成细小的颗粒和糊化淀粉，并杀灭外来的微生物，使蛋白质变性以提高酶的效率（denature proteins to enhance enzymatic attack？？？），使叶酸变得更容易提取。在食物中的叶酸可以自动绑定到不同链长的谷氨酸残基上。绝大部分自然产生的叶酸不可以通过机体实验检测出来。叶酸（pteroylglutamic acid碟酰谷氨酸）可以通过三酶系统（the matrix by a triple enzyme system？什么是三酶系统？）提取出来。一种蛋白酶和一种淀粉酶用于消化食物基质，并有助于释放叶酸。干燥的鸡胰腺结合酵素（？？？）常用来水解folylpolyglutamates（？？？）用于folyldiglutamates（？？？）叶酸，可以用于机体检测。释放出来的叶酸可以被培养基上的营养物质稀释并能被提取，并且活的干酪乳杆菌ATCC 7469对样品的反应所产生的溶液浊度也可以通过比照标准溶液来定量。这个方法是通过有选择的使用96微孔板和配套仪器来取代半自动比浊仪的测定标准。 D．接种 （a）测试生物：活的干酪乳酸杆菌ATCC 746； （b）Cryprotected（？？？） 接种：溶解4.7g 叶酸杆菌介质（BD 生物科学编纂号 NO.282210）在50ml 蒸馏水里。加热至沸腾，在冰上冷却，接着加入50毫升水和25mg 抗坏血酸钠。加入0.5ml 稀释过的叶酸标准溶液，混合均匀，并用无菌过滤器过滤。用上述的无菌过滤过的培养基溶解一小瓶冻干干酪菌。转移0.15ml上述的培养基悬浮液。在37度的环境下孵育18h。混合120ml甘油和30ml水，高压灭菌后，冰浴。冷却培养基后加入100ml 80%冰冷的甘油。缓慢轻柔地混合，等分成每份2ml至无菌管中（偶尔搅拌悬浮液以维持溶液悬浮）。管可以放置于-20度的环境下3个月左右，-70度的环境下可以保存6个月。 （c）工作接种（？？？什么叫工作接种）：对每管的培养基，将2ml冰冷的悬浮液加入到50ml无菌盐水中稀释，在涡旋振荡器上混合。用该悬浮液作为工作接种。 对96微孔板来说，直接从冰箱中取5ml无菌的盐水加入到2ml的溶液中。在涡旋振荡器中混合，将该悬浮液作为工作接种。 E．准备样品溶液 （a）产品准备：研磨固体样品至能通过40目筛子，并能储存在密封容器中，避免光线直接照射； （b）水解和提取：除非另有规定，本方法采用试剂均为分析纯，水则都使用蒸馏水； （1）标准---10ng/ml。吸取1ml的工作标准溶液（1ug/ml），C（vv（2））（？？？），至125ml的锥形瓶装有20ml 磷酸盐缓冲液，PH=7.8，C(gg)，混合并加入30ml水； （2）测试样品---准确称取测试的部分，等同于0.25-1.0g干的基质固体，至各自内含有1 ug叶酸的125ml的锥形瓶中。加入20ml PBS，PH=7.8，搅拌均匀。（如果产品只有较低含量的叶酸，不要取1.0g，为了补偿低水平的叶酸，在下述的第二步的稀释中采取较大的等份）。用无菌水稀释至50ml，加入0.1-1.0ml 的辛醇（消泡剂）至所有的锥形瓶中。用50ml的烧杯盖上锥形瓶，121-123度高压灭菌15分钟，并冷却。 在每个锥形瓶中加入额外的10ml缓冲液。加入1ml 蛋白酶溶液，并在37度的环境下孵育3小时。高压灭菌的方法灭活酶（或者热水浴）100度3分钟，并冷却。加入1毫升α-淀粉酶溶液至每个锥形瓶，盖好瓶盖，在37度环境下孵育16小时。加入4m