秋茄實验方法与步骤.docVIP

胁迫前将秋茄苗（半年）从花盆中取出，先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水和超纯水清洗，用滤纸擦干后放入装有4L胁迫液（浓度分别为0，0.2；1；10；50ppm的Hg2+）的桶中胁迫5天，每桶5-10株幼苗。每处理重复三次，共计15盆，约150棵幼苗。测定指标：一、幼苗叶片中Hg的分级 二、植物体内汞形态分析 三、叶绿素含量的测定 四、抗氧化酶的测定 五、丙二醛含量的测定 六、植物络合素的测定（GSH和NPT） 具体方法步骤如下： 一、幼苗叶片中Hg的分级 将叶片清洗干净后（自来水+蒸馏水+超纯水），取1g叶片去除叶脉，在-3.5Kpa的压力下，用3mlpH6.5的50mM MES-Tris缓冲液真空抽滤渗透2次，滤液至于锥形瓶中,中间放气1次（大于2min），然后在85ml?美国进口的离心管（15ml离心管）中4000g，4度下离心15min，得到上清液即质外体汁液，将上清液转移至试管（依据量的多少看定容到多大容量瓶）中测定汞含量。将残叶于-20度冰箱冷冻2天，自然解冻后，于15ml离心管中4000g，4度下离心15min，然后用乙醇洗涤残叶离心收集汁液，重复2次，合并3次获得的汁液为共质体组分，最后残渣部分为细胞壁。细胞壁成分用硝酸消解后测定汞含量（pH6.5的50mM MES-Tris缓冲液的配置：MES= 2-(N-吗啡啉）乙磺酸三羟甲基氨基甲烷 三、叶绿素含量的测定 混合液的配置：用纯丙酮、无水乙醇和蒸馏水按4.5:4.5:1的比例配成混合液备用。 叶绿素浸提：选取新鲜成熟叶片，去除中脉剪碎混匀，称取约0.15 g叶片放入15mL 离心管中，加入10mL混合备用液，振荡后避光保存。当观察到叶片组织变白时，进行光密度测定。 叶绿素含量测定：取3mL叶绿素叶绿素浸提液，盛入10mm比色皿中，用混合液作对照。用分光光度计测定645nm和663nm的光密度值，根据以下公式计算叶绿素含量： Ca（mg/g）=[12.7×OD663－2.69×OD645] ×V÷1000÷W Cb（mg/g）=[22.9×OD645－4.86×OD663] ×V÷1000÷W Ca+b（mg/g）=[8.02×OD663+20.20×OD645(2.3)] ×V÷1000÷W V是浸提液的最终体积 W是叶片鲜重 四、抗氧化酶的测定 4.1酶液的提取 分别取相对稳定的1g叶片和根尖样品，剪碎，在预冷的研钵中分次加入0.05 mol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）5ml以及少量的PVP和少量石英砂于冰浴下研磨,转移至15ml离心管中，再用5ml缓冲液清洗研钵中的残余。匀浆在高速冷冻离心机上4℃19000×g离心10min，上清液用于酶系活性测定。（提取的酶液即为10ml） 4.2可溶性蛋白含量测定 按照李合生等的方法用考马斯亮蓝G-250进行染色，在波长为595nm处进行比色。用牛血清蛋白作为标准蛋白。 试剂:标准蛋白质溶液:100μg/mL牛血清白蛋白:称取牛血清白蛋白25mg,加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40mL,用蒸馏水稀释至100mL即可。 考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90%乙醇中，加入100mL 85%（w/v）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。 仪器：722分光光度计，研钵，烧杯，量瓶，移液管，具塞刻度试管 标准曲线制作表 试管号 1 2 3 4 5 6 蛋白标准溶液/ml 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水量/ml 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0 考马斯亮蓝/ml 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量/μg 0 20 40 60 80 100 （1）标准曲线制作：取6支具塞试管按表所列加入各试剂，摇匀。放置3min，用1cm光径比色皿在595nm波长比色。以牛血清蛋白含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲 （2）样品测定：取酶提取液40μl，置于具塞试管中，加入pH7.8的磷酸缓冲溶液至总体积为1ml，加入5 ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置3min。595 nm波长比色，比色反应在1 h内完成。 （3）计算：根据样品提取液的吸光度，从标准曲线中查出相应的蛋白质含量，按下式计算样品中蛋白质含量。 P=（C×V）/（W×Vt） C----查得的蛋白质含量（由标准曲线求得），μg； V----提取液总体积，ml； Vt----测定时所吸取的体积，ml； W----样品重，g； P ----蛋白质含量（鲜重），μg/g。 4.3超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定 采用氮蓝四唑（NBT）法测定。 试剂：0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.8） 130mmol/