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南疆蒙古族宫颈癌患者HPV16存在状态的研究 　　【摘要】目的本文通过对新疆巴音郭楞蒙古自治州48例宫颈鳞癌患者宫颈癌组织中HPV的检测分型，并调查其中HPV16型在组织中的存在状态，分析HPV在南疆蒙古族宫颈癌患者中的分布和存在状态。方法蒙古族宫颈鳞癌癌组织样本48例，应用PCR杂交技术检测分型，并应用多重荧光定量PCR检测HPV16基因的存在状态。结果①HPV在48例蒙古族宫颈癌患者鳞癌组织中共检测出3种HPV病毒，分别为HPV16、HPV18和HPV68型。HPV总阳性者48例（100%），其中HPV单一感染者37例（77.08%），多重感染者11例（22.92%）；②有39例E2/E6值在0.05-0.81范围内，为混合型，占总例数的82.78%，有6例为游离型，占总例数的12.76%，另有2例为整合性，占总例数的4.26%。结论南疆蒙古族宫颈癌患者HPV分布与新疆汉族、哈萨克族宫颈癌患者基本一致，但是区别于新疆维吾尔族宫颈癌患者，在检出的HPV16型感染的宫颈癌患者中，HPV16基因混合型占绝大多数。 　　【关键词】南疆蒙古族宫颈癌患者；HPV16 　　研究发现90%以上的宫颈癌伴有人乳头瘤病毒（HPV）的感染，大量的病因学证据研究也佐证了HPV持续感染是宫颈癌发病直接重要的因素之一[1-2]。HPV是一类含双链环状DNA 核的衣壳病毒，按功能可将其分为3 个基因区，分别为上游调控区（upstream regulatory region，URR）、早期基因区（early region genes，E 区）和晚期基因区（late region genes，L 区）。E 区基因编码早期蛋白，其中E2、E6、E7基因的复制、表达与宫颈癌致病密切相关[3-4]，同时E2、E6的比值则代表HPV16型在人体内与宿主基因的整合率。大量的研究证实，HPV16在宿主基因组中的整合率随着病变级别的升高有明显的上升趋势[4-6]。新疆是中国宫颈癌的高发地区之一，然而新疆蒙古族宫颈癌患者HPV病毒感染的分部和存在状态尚未见报道。本研究对南疆巴音郭楞自治州的蒙古族宫颈癌患者宫颈病变组织中的HPV存在状态进行检测，分析其与其他少数民族的差异。 　　1对象与方法 　　1.1研究对象选择2012年3月――12月我院妇科住院及门诊的蒙古族宫颈鳞癌子宫颈组织石蜡包埋的标本48例，均为活检和术前未接受放化疗标本。48例宫颈鳞癌患者平均年龄37.4岁（26-64岁）。由于样本较少，宫颈癌的临床分级机病理组织学分级未纳入此次实验统计。 　　1.2基因组DNA的提取48例石蜡包埋样本无菌操作连续切片，4张10μm的石蜡切片放入1.5ml的灭菌EP管中。严格按照以下石蜡基因组提取试剂盒（德国QIAGEN公司）操作步骤进行。在放有组织蜡片的EP管中加入1ml二甲苯，充分混匀10s，全速离心2min，弃上清。加入1ml无水乙醇，充分混匀，离心14000rpm2min，弃上清。打开EP管，37℃孵育10min，至残余乙醇全部挥发；加入180μlBufferATL和20μl蛋白酶K，充分混匀，56℃水浴过夜；第二天水浴锅90℃孵育1h，加入200BufferAL和200μl无水乙醇，充分混匀，短暂离心；转移全部消化物至QIAamp层析柱上，4℃离心8000rpm3min，弃去离心下来的液体，再加入500μlBufferAW1，4℃离心8000rpm3min，弃去离心下来的液体，加入500μlBufferAW2，4℃离心8000rpm3min，弃去离心下来的液体；将QIAamp层析柱放入一个1.5ml的EP管中，加入50μlBufferTE，室温孵育1min，4℃12000rpm离心3min，收集液体为溶有基因组DNA的TE缓冲液；取5ul的基因组DNA进行琼脂糖凝胶检测提取效率。 　　1.3HPV分型检测应用广州凯普公司提供的HPV分型检测试剂盒、核酸分子快速杂交仪和基因扩增仪对48例样本中HPV进行分型检测。结果采用肉眼观察，清晰可见的蓝紫色圆点为检测阳性，并根据试剂盒提供的HPV分型图判断HPV亚型。 　　1.4HPV16 E2/E6基因比率的多重荧光定量PCR检测HPV分型结果，48例检出HPV16型阳性为47例，对该47例样本提取的基因组DNA进行同一体系下的荧光实时定量PCR检测：反应体系为30μl，其中模板DNA2μl，0.2μmol/LE2引物，0.2μmol/LE6引物，0.33μmol/LE2及E6荧光探针，15μl Premix Ex Taq（2×），0.6μl ROX Reference Dye（50×），9μl双蒸水。多重荧光定量PCR扩增参数为：97℃预变性30s，97℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s，4