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乳品中真蛋白SDS—PAGE检测及鉴定图谱库建立 　　【摘 要】本文应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）技术，建立乳品中真蛋白组份和含量的准确检测方法，建立乳制品蛋白质的组分及含量分析的SDS图谱库，并制定该数据库相应的判定规则与方法；对待测乳品样品进行相应程序的分析，与标准比对进行乳品质量的判定与评价。如果样品本身质量优良，那就不必进一步进行假蛋白筛查；如果真蛋白检测指标有可疑，产品可能有掺假，就要进行掺假检测。 　　【关键词】聚丙烯酰胺凝胶电泳；乳品中真蛋白组份和含量检测；乳制品真蛋白质SDS图谱库 　　近年来，乳品行业迅速发展，但由于市场需求大于奶源的供应，乳品生产中出现了掺假现象，以复原乳代替生鲜牛乳、乳品中添加氨基酸、淀粉类物质、用蛋白粉、脂肪粉等勾兑原料乳等问题的出现，扰乱了乳品行业的市场秩序，危害了人们的身体健康[1][2]。 　　乳中的氮含量包括蛋白态氮（Protein nitrogen，PN）和非蛋白态氮（Non-protein nitrogen，NPN），其中前者占95%，后者约占5%。蛋白质是乳中的主要含氮物质，含量2.8%-3.8%。乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白及少量脂肪球膜蛋白。乳清蛋白中有对热不稳定的乳白蛋白和乳球蛋白[3]。真蛋白（true Protein，TP）即指这些除了非蛋白质氮以外的蛋白态氮所计算得到的蛋白，由于其可较好地反映乳品的真实营养价值，因此，真蛋白是乳品质量优劣的重要标志之一[4][5][6]。造假者利用劣质动物水解蛋白来提高蛋白质检测值的现象可能无法通过凯氏定氮法检测出来[3][7]。此外，紫外吸光光度法、比色法也是常用的蛋白质快速检测方法，但该方法易受到其他物质干扰，不适合复杂基质的样品分析，而氨基酸分析法受到蛋白质水解方法的限制，均对检测结果有影响[7]。 　　SDS具有分子筛效应，根据蛋白分子量亚基的不同来分离蛋白，能够有效分离乳品中的主要蛋白质，达到定性、定量测定蛋白中主要蛋白成分的目的，是蛋白质分析中较为常用的方法，也是乳清蛋白研究中较为广泛的方法，该方法虽然不能有效分离乳清蛋白中的免疫球蛋白，但是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白能很好的分离开[8][9]。 　　本文采用SDS方法检测不同乳品中真蛋白，并建立真蛋白SDS鉴定图谱库。 　　1 材料和仪器 　　1.1 标准品和试剂 　　标准品：低分子量标准蛋白（15.5—97ku），大连宝生物工程公司； 　　标准蛋白及分子量：α-乳白蛋白14.3kD，β-乳球蛋白18.4kD，α-酪蛋白22.5kD，β-酪蛋白24kD，κ-酪蛋白23kD，都为优级纯（美国sigma公司） 　　大豆蛋白粉、明胶分析纯；丙烯酰胺（Acr） 、Tris 、N-N-甲叉双丙烯酰胺（Bis） 优级纯；TEMED；十二烷基硫酸钠（SDS） 优级纯；过硫酸铵（Ap） 分析纯；四甲基乙二胺（TEMED） 优级纯；巯基乙醇；BCA 优级纯（美国sigma公司）；碳酸钠、酒石酸二钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、硫酸铜、乙酸、过硫酸铵、甘油、溴酚蓝、甘氨酸、盐酸、甲酸等均为分析纯。 　　30%丙烯酰胺单体贮液，分离胶缓冲贮液，样品缓冲液，5.0mL浓缩胶缓冲贮液，电极缓冲液，染色液，固定液，脱色液按照相关参考文献制备。 　　1.2 材料 　　乳清粉为进口检验样品；奶粉样品为市售各种进口和国产品牌，来自不同厂家的奶粉样品。包括各个阶段婴幼儿奶粉、儿童奶粉、成人营养奶粉、老年人奶粉等。对于婴幼儿奶粉着重选取不同品牌的同一阶段奶粉进行比较，选取同一品牌各阶段奶粉，购自大连市各大超市。 　　1.3 仪器 　　SDS电泳仪；电泳槽HoeferminiVE型；电泳仪BG.Power600型；UVP凝胶成像仪；高速冷冻离心机；727分栅分光光度计；DYY-6C电泳仪（北京市六一仪器厂）；DYCZ-24D型垂直板电泳槽（北京市六一仪器厂）。 　　2 方法 　　2.1 乳品中蛋白质组分和含量SDS检测方法建立 　　2.1.1样品制备 　　根据文献报道[10]，制备样品。 　　奶粉：取1 g加入10 mL蒸馏水（60 ℃）溶解，加入0.6mol/L三氯乙酸1mL，振动混合5 min，分3次加入5 mL乙醚，1 500 r/min离心5 min。倾去醚层和水层，在沉淀的蛋白质中加入50mmol/L Tris.HCI（pH值为8.0），洗涤3次，洗去三氯乙酸，真空干燥成粉。测定可溶性蛋白质含量；称取蛋白10mg，测定蛋白质组成。 　　乳清粉：取1g加入10mL蒸馏水溶解，过0.45μ针头式过滤除脂，吸取滤液200μL，直接溶于1mL电泳上样缓冲液，测定蛋白质组成。 　　取400μL奶粉样品加入1ml 冷丙酮（-20℃）过夜沉淀，10000r/min