信号通路研究相关技术(WBIPIHCIF).ppt

* * * * * * * * * * * * * * (六)抗体的保存和稀释 抗体应于低温保存，不宜反复存放于4度和-20度之间。检测试剂盒一般存放于4度，不宜于-20度保存，如长时间不用可存放于-20度，解冻使用后则不能再存放于0度以下，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易分解，导致检测的敏感度降低。 浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。日常工作量不多时，可将抗体稀释至1:5~20，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价时否有所降低，避免出现假阴性染色。 实验计划 每次实验前应列出详细实验计划，其中包括实验目的、拟用方法、所用一抗和二抗的种类和效价、预实施的操作流程方案以及预期实验结果等。实验分组编号用玻璃笔标记在玻片上，对每一抗体均应配以阳性和阴性对照。 抗体的稀释度 抗体稀释度，即抗体浓度。组织中抗原的免疫染色是通过适宜的抗体溶液系统而得以定性和定位，因而抗原与抗体浓度的比例十分重要。最佳的抗体稀释度可提高染色质量，与周围组织或细胞形成良好的染色对比。如果抗体浓度过高，反而减少抗体与抗原的结合，甚至导致假阴性结果，故各实验室每当使用一种新抗体时，必须试用多种稀释度，从中确定最佳工作浓度，以防假阴性结果的出现。由于标本的固定、切片种类、稀释液种类和湿盒等具体条件均可影响稀释度，故在测试之前必须使这些条件稳定。稀释度应选择阳性反应着色最强、背景着色最弱的滴度。 抗体稀释液 SignalStain? Antibody Diluent #8112 TBST/5% normal goat serum (#5425): To 5 ml 1X TBST add 250 μl normal goat serum. PBST/5% normal goat serum (#5425): To 5 ml 1X PBST add 250 μl normal goat serum.1X PBS/0.1% Tween-20 (1X PBST): To prepare 1 L add 100 ml 10X PBS to 900 ml dH20. Add 1 ml Tween-20 and mix.10X Phosphate Buffered Saline (PBS): To prepare 1 L add 80 g sodium chloride (NaCl), 2 g potassium chloride (KCl), 14.4 g sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) and 2.4 g potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) to 1 L dH2O. Adjust pH to 7.4. 滴加抗体注意事项 切片在血清封闭后，倾去多余血清，便可滴加第一抗体。滴加前取出玻片，用吸水纸拭去组织周围的液体，组织与细胞表面的液体要用滤纸条轻轻吸掉，但注意勿使组织干燥，尽快滴加抗体工作液1滴(约50ul)于组织表面。由于切片周围无液体，滴加的抗体成为一个液滴，这样既可节省抗体，又可增加抗原与抗体结合的机会。如果玻片上是培养细胞，应在镜下选择一个理想的区域用免疫组织化学油笔在此区域外围画一圆圈，再滴加抗体，尔后应轻轻摇动切片数秒，以促进抗体与组织待测抗原的结合，避免假阴性小区的出现。这一操作过程虽然简单，却十分重要。加抗体时切忌加样器或吸头碰到组织或细胞，以免造成破损。 (七)酶标抗体系统中的酶与显色剂 在常用免疫组化方法中，与抗体连接的酶主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶(HRP或AP), 显色剂有DAB、AEC、固红和固蓝等。在HRP系统用DAB和AEC等作显色剂，DAB显色阳性物呈棕色，AEC呈红色；AP系统用固红和固蓝作显色剂，固红显色阳性物呈红色，而固蓝呈蓝色。DAB显色形成的沉淀物最稳定和不易褪色，较为常用，因其是致癌物，故要避免接触皮肤和污染环境。 Available Detection Systems: SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125 (八)实验对照 为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。1．阳性对照:选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。初学者应设阳性对照。2．阴性