染色质免疫共沉淀技术的发展.docVIP

染色质免疫共沉淀技术的发展摘要：本文主要介绍了染色质免疫沉淀技术的发展历程、基本原理和优缺点，并且介绍了反向染色质免疫沉淀技术，并对两种方法进行了比较。 关键词：染色质免疫共沉淀；反向染色质免疫共沉淀；应用，研究前景。 目前，不断发展的DNA和蛋白质相互作用的方法和技术已经成为研究DNA复制、重组、修复和转录的核心。其中凝胶阻滞实验（EMSA），报告基因分析，DNA微阵列，质谱分析法MS，酵母单杂交系统和染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是被广泛应用于研究DNA和蛋白质相互作用的方法。 真核生物基因组DNA以染色质形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径。生物体内基因表达调控主要发生在转录过程中，转录调控是顺式作用元件 Cis-acting elements 如启动子 Promoter 、增强子 Enhancer 与反式作用因子 Trans-acting factors 相互作用的结果。基因组DNA的甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化和磷酸化修饰，核小体重新定位及染色体结构重建都影响调控。转录调控具有细胞类型、发育阶段和外界环境刺激的差异性，哺乳动物转录调控序列分散在较大区域，组蛋白修饰状态达100多种，这些因素都增加了转录调控的复杂性。 ChIP是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子结合位点的信息，确定其直接靶基因。它早期多被用于研究核小体上的DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来，随着生物技术的迅速发展，ChIP技术不断发展和完善，被广泛应用于体内转录调控因子与靶基因启动子上特异核苷酸序列结合方面的研究，并成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。特别是，此技术与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量筛选已知蛋白因子的未知DNA靶位点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入研究DNA与蛋白质相互作用的调控网络。 ChIP技术由Orlando等于1997年创立。其基本原理为将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解，染色体分离并打碎为一定大小的片段；然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物，对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联，DNA与蛋白质之间的Schiff键水解，释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测，获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。在上述ChIP过程中，甲醛能够进入细胞并使蛋白质与DNA或蛋白质与蛋白质之间通过希弗 Scihff 键交联，形成稳定结合的复合物。如果交联效果不太好，可以先用交联剂DMA Dimethyl adipimidate 或DSG Disuccnimidyl glutarate 处理细胞，以加强后续甲醛交联的效果。破碎DNA可采用超声物理破碎或特定酶切消化，以获得所需长度的DNA片段。由于DNA片段长度将影响抗体免疫沉淀效率，因此破碎DNA是ChIP实验成功与否的重要因素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的液体应从浑浊状态变为透明状态。选择专一性及亲和力较高的抗体是ChIP成功的关键。非特异性抗体将增加大量的非目标靶点DNA片段信息，从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息；而亲和力较差的抗体，则无法获得高信噪比靶点DNA片段。另一方面，在甲醛交联过程中可能会掩盖一些蛋白质的表位，这会影响到一部分蛋白质和DNA复合体的免疫沉淀反应。因此，用Western印迹或免疫组化等常用的实验方法证明的能够对目标蛋白质进行免疫结合的抗体，并不能保证一定能够成功地进行ChIP实验。例如，Weitsman 等检验了不同的雌激素受体β抗体在ChIP中的免疫沉淀能力， 发现有的抗体虽然能够在标准免疫沉淀条件下与抗原结合，但不适合ChIP条件下使用，并且不同抗体的结合效率也有差异。对于某一目标蛋白采用多种抗体组合来进行ChIP实验是一种有效的方案。例如，Chen 等针对CTCF在人类基因组中的结合位点研究，采用了多种不同单克隆抗体的混合物进行免疫沉淀。另外，有人利用表位附加标记技术表达融合蛋白进行免疫沉淀实验。常用的表位附加标记有红血球凝集素 Hemagglutinin 、生物素和c-Myc等。但哺乳动物细胞中难以引入表位附加标记的融合蛋白，并且其表达往往不同于其内源转录因子。染色质免疫沉淀获得的DNA数量往往很多，其中包含大量的非特异结合造成的背景噪音，采用严格的洗涤条件可以降低背景。Ogryzko等将靶蛋白与生物素受体片段融合表达， 通过抗生物素磁珠免疫沉淀，二者较强的结合力便于进行更为严谨的洗涤，达到降低背景的目的。 与传统的研究转录因子和DNA相互作用的方法