多靶点pCRISPR载体.docx

CRISPR-derived genome editing technology A pYLCRISPR/Cas9-MT(II) vector system for targeting mμltiple gene sites of dicot plants 华南农业大学 刘耀光实验室 1. CRISPR-Cas9核酸酶切靶序列原理图示： 2 相关载体图谱 2.1 CRISPR—gRNA vector： 注：用载体骨架隔开U6启动子和gRNA区，可以避免没有被BsaI切断的空载分子被PCR扩增，见后面说明 2.2 CRISPR双元载体 (双子叶植物用，也可用于单子叶植物，但pYLCRISPR/Cas9-MT(I)更合适单子叶植物) 3. 基因组靶位点选择和双链接头设计 3.1 靶位点选择 （1）在目标区如果能够找到NGG上游第20碱基是A（用U3启动子）或G(用U6启动子）的序列（ (U3或U6启动子转录起始碱基），优先选为靶序列 合成接头的形式（U3启动子右上，U6a启动子右下） 注意：接头的2个粘性末端不互补 (2) 如果在NGG上游第20碱基不是A或G，可选20碱基为靶序列（Kabin Xie and Yinong Yang， 2013， Molecular Plant) 合成接头的形式（U6a启动子） 为了提高突变效率，对一个目的基因设计多个靶点。建议在ORF 5’区和中部区域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。  几个靶位点设计例： 左图：切点在起始密码附近或尽量在ORF上游，或在特定的功能域 (可能引起密码子缺失和移码) 右图：切点在外显子末端或前端（可能引起移码，或内含子识别位点缺失使内含子不被剪切） 特异性检查：虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题（万一有负面作用的脱靶发生，与原受体亲本杂交就可排除），但应该将候选靶序列+NGG（5’端加几十碱基）对目标基因组做Blast，避免在靶序列3’端+NGG与其它功能基因有高相似性。但是打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时，就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。 3.2 靶位点接头设计例 4. 多靶点pYLCRISPR/cas9-MT(II)载体构建 4.1 gRNA表达盒构建示意图（三靶点为例） Note: stick ends B1’ and BL are complementary to the B1 and BL’ ends in pYLCRISPR/Cas9-MT (I)vector, respectively. 为了提高接头连接效率，使用较高的接头浓度（0.05-0.1 μM），这样主要是产生线性连接，而环状连接较少。但2种方式在随后的PCR中，都是通过上游片段正链和下游片段负链通过接头序列配对延伸而产生完整的目标片段 4.2 gRNA表达盒扩增引物 For T1： Ugccg-B1’: ATAAATTggtctcagccgTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 （U6启动子上游引物） gRctga-B2: ATAATTTggtctcttcagCCATCCACTCCAAGCTC-3 (gRNA引物) For T2: Uctga-B2’: ATAAATTggtctcactgaTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRaaga-B3: ATAATTTggtctcttcttCCATCCACTCCAAGCTC-3 For T3: Uaaga-B3’: ATAAATTggtctcaaagaTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRgact-B4: ATAATTTggtctctagtcCCATCCACTCCAAGCTC-3 For T4: Ugact-B4’: ATAAATTggtctcagactTGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRgttt-BL: ATAATTTggtctctaaacCCATCCACTCCAAGCTC-3 4.3 靶标gRNA表达盒排列 目前只有1个U6启动子，该启动子在双元载体的多次重复排列可能在农杆菌发生重组变异。建议目前版本构建最多3-4个靶点。我们正在克隆更多的拟南芥U3/U6启动子，以方便做更多靶点的稳定载体. 引物使用方法 1个靶点：用引物对B1’/BL 扩增相应的pU-T1-gRNA 2个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/BL 扩增相应的pU-T1-gRNA, pU-T2-gRNA; 3个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/B3, B3’/BL 扩增相应的pU-T1-gRNA, pU-T2-gRNA, pU-T3-gRNA; 4个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/B3, B3’/B4, B4’/BL 扩增相应的pU-T1-g