大鼠神经干细胞分离培养鉴定标准化protocol.doc

 PAGE \* MERGEFORMAT 9 大鼠神经干细胞分离培养鉴定标准化protocol 一、大鼠神经干细胞分离和传代步骤 手术前准备1. 水浴锅温度调至 37° C。 组织解离液置 95%O2 5%CO2 培养箱中 10min。 3. 用 95%乙醇消毒解剖区。4. 用消毒溶液消毒解剖器械（戊二醛，后用无菌 dH2O 冲洗，浸泡在 95%乙醇中）。 在 3 个 60 × 15 mm 皿中各加 3ml 的组织解离液。 提示：除无菌显微解剖器材外，还要三套消毒器械，分别用于剥离皮肤、颅骨和脑，减少用手污染的机会。消毒过的解剖器械可以浸泡在无菌组织剥离液中，以避免乙醇接触组织。 分离脑组织 新生SD大鼠(出生48h内)直接断头。 剃去头顶的毛发。 用浸泡过聚维酮碘消毒的纱布擦洗头部并且去除松散的毛发。 用泡过 95％乙醇消毒纱布擦洗头部。 用手术刀片延中线全长切开头皮。 掀开皮肤显现出头盖骨。 从双耳后切开头皮暴露头盖骨侧面。 用小剪刀在两边切开头盖骨（打开头盖骨上部，避免损伤脑组织）。 用镊子掀开头盖骨。 注意：不能用表面有乙醇的解剖工具接触脑组织。乙醇能使组织固定。 用弯镊在脑底部滑动以切断连接脑底部的脊髓、血管和颅神经。 提示：用弯镊时轻微向下用力抵住脑下面的颅底。来回滑动松动脑组织。 取脑组织，D-Hanks液充分漂洗后. 用同一个弯镊将脑移到盛有解离液的 60mm 皿中。 剥离大脑表面的脑膜，冲洗干净，把脑放入第二个盛有解离液的 60mm 皿中。 提示：在解剖显微镜下很容易剥离脑膜。 解剖镜下，沿中线切开大脑，精细镊分离海马。 将分离组织放置于第三个盛有解离液的 60mm 皿中。 用 10 号弯头手术刀将组织切成小块（约 1 mm3） 分散脑组织 将盛有小块组织的培养皿移到超净台， 然后用移液管将组织块移到 5ml 的圆底聚丙烯管中。 250g 离心 1min。 弃上清，加入酶混合液（1ml） 。 将试管水浴至少 40min，每隔 20 分钟用移液管适当吹打。 26. 250g 离心 5min，弃上清。 加入 4ml 蛋白酶抑制剂。 用移液管吹打 10 次以分散沉淀，注意尽量别产生气泡。29. 水浴 10min。 30. 500g 离心 5min，弃上清。 用 0.5ml SFM 重悬细胞，充分吹打以产生单细胞悬液。 提示：建议用火焰钝化的小抢头制备单细胞悬液。 接种细胞32. 用血细胞计数器计数并调整活细胞浓度。台盼兰染色排除死细胞。 提示：接种 10-15 cells/ul有利于建立单个神经球的培养。如果不做克隆分析且想获得更多神经球，可提高接种密度（如 50-100 cells/ul）。高密度接种可加快神经球的形成，并缩短首次传代时间间隔。 用血细胞计数器和台盼兰测定细胞活性在 24 孔板每孔中加入 0.5ml 含细胞 SFM。 在 24 孔板每孔中加入 0.5ml 含细胞 SFM。 37° 95% air 5% CO2 培养。 神经球的传代提示： 在合并培养物前应检查每个孔是否污染， 特别是在第一次传代时。 严重污染使 PH 值降低， 培养液颜色明显改变（变黄）。轻微污染也较常见，无法通过观察培养液颜色判断，需在相差显微镜下观察。如果你忽略了一个污染孔，下一代的所有孔都会被污染！ 将所有神经球和培养液移到 15ml 锥形管。 2. 200g 离心 5min。 弃上清，加入 2ml TrypLETM。 用移液管混合神经球和 TrypLETM。 5. 37° 水浴 20min。 6. 500g 离心 5min。 弃上清，加 0.5ml SFM 重悬细胞。 用移液管吹打（60－70 次） 提示：吹打过程中避免产生气泡。过多气泡会降低活细胞数并增加污染机会。 9. 用台盼兰计数细胞密度， 排除死细胞， 按所需密度接种到新 24 孔板。 95% air 5% CO2 37° 培养。 提示： 神经球传代的最佳时间常根据试验需要和时间安排确定。 如果平均每孔至少 25 个神经球， 那么可以传 2 个板。如果有 50 个神经球，那么很容易从原 24 孔板传 3 个板。镜台测微尺可标准化相差显微镜的目镜焦距。便于快速确定神经球的大小。神经球的冻存和复苏1. 将含有神经球的培养液从 24 孔板移入 15ml 圆锥管。 2. 200g 离心 5min。 3. 弃上清，用 10ml 含 15％DMSO 的 SFM（不含 EGF 和 FGF）重悬细胞。 用移液管轻轻混匀，分装 1.5ml 每管（聚丙烯冷冻管）。 5. －80° 冰箱过夜。6. 次日晨转移至液氮罐保存。 提示：如果不能使用液氮，神经球可以在－80° 保存几周。活神经球数量会