分子生物学实验基础h资料讲解.pptVIP

　 　 　　1.　原核表达体系 E.coli的标准： 选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli的不足： 缺乏转录后加工机制 缺乏翻译后加工机制 表达产物形成不溶性包涵体 很难表达大量可溶性蛋白 　 　 2.　真核表达体系 　　 如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 　可适当修饰表达的蛋白质 　表达产物分区积累 缺点：操作技术难、费时、不经济 转染：将表达载体导入真核细胞的过程 　 　 三、重组DNA技术与医学的关系 疾病基因的发现 发展生物制药 DNA诊断 基因治疗 遗传疾病的预防 　 　 复习思考题： 　1. 概念： （1）克隆 （2）转化 （3）转位 （4）基因工程 （5）转座 （6）限制性核酸内切酶 （7）载体 （8）G文库 （9）质粒 （10）c文库 2. 简述基因工程的基本过程。 3. 简述目的基因的主要来源或途径。 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 柯斯质粒（cosmid） 酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BAC） 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录 病毒） （二）工具酶 基因的分离和重组，涉及到一系列相互关联的酶促反应，已知道有许多重要的核酸酶（如限制性核酸内切酶、连接酶、聚合酶、末端转移酶等等）在基因克隆实验中有着广泛的用途。而其中限制性核酸内切酶和连接酶的发现和应用，才真正使DNA分子的体外切割与连接成为可能，是DNA重组技术赖以创立的重要酶学基础。 1、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 定义 是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。常形象地称之为核酸分子的“手术刀” 。 命名 eg：EcoRI 、HindⅢ 分型 　　识别DNA的特异序列，并在识别位 点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 　　 是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。 ··· ··· GGATCC ··· ··· ··· ··· CCTAGG ··· ··· 特性 Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型 限制和修饰活性 同时具有内切酶、 核酸内切酶 类似I，多功能酶 甲基化酶活性 酶的蛋白结构 3种不同的亚基 单一的成分 2种不同的亚基 所需的辅助因子 ATP、Mg2＋ 、 Mg2＋ ATP、Mg2＋ 、 S-腺苷甲硫氨酸 S-腺苷甲硫氨酸 切割位点 在距特异性位点至少 位于特异性位点 距特异性位点3’端 1000bp的地方可能随 或其附近 24～26bp处 机地切割 序列特异的切割 否 是 是 在DNA克隆中的 无用 十分有用 用处不大 用处 核酸内切限制酶的类型及其主要特性 活性单位 在一定的反应条件下（pH、温度、离子浓度等）和时间内(60分钟)能够完全酶解1μg的DNA分子底物所需的酶量 识别、切割序列 能识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列（称为核