培养细胞常用染色与固定方法解析.docVIP

培养细胞常用染色与固定方法 培养细胞常用染色与固定方法 一、普通染色观察 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般 形态的最常用方法， 也是把细胞作为标本保存的主要方法。 对于贴壁培养的细胞， 以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、BSS 或生理盐水清洗培养物2次，去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴 于载玻片上，以利操作。对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000r／min， 10min)， 弃上清液后(留少量液体)， 将细胞悬液滴于玻片上做成涂片， 冷风吹干。 （一）HE染色法 1.染液配制 (1)苏木精染液：这里介绍鄂征(1995)改良的Mayer法。称取0.5g苏木精，5.0g 铵矾或钾矾， 0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水。 再加入30ml甘油， 2ml冰醋酸。 混匀。过滤后即成母液。可长久保存。用蒸馏水以1:20稀释即成工作液，可用 很长时间。每次染色前宜过滤，去除氧化膜。 (2)伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分。将0.5g伊红溶于100m170％乙醇或 蒸 馏水即成工作液。 2.染色程序 （1）用10％甲醛(福尔马林)固定培养物30min，或以丙酮固定15min。 （2）蒸馏水洗1次后，入苏木精染液5～10min染细胞核。 （3） 入0.5％盐酸-70％乙醇溶液30～1min， 脱去胞质的着色。 此时核呈紫红色。 （4）入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。如果时间允许，最好用自来水(呈弱 碱性)长时间浸泡。也可入1％NaHCO3溶液。此过程须不断用显微镜监视，以掌 握碱化时间。 （5）蒸馏水洗1 min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色。 （6）入伊红染液30s～1 min。 （7）用梯度乙醇溶液脱水：70％、90％、95％乙醇各30s～1 min；100％(2次) 各2min。如伊红为乙醇溶液，略去70％乙醇。 （8）用二甲苯透明2次，各5min。 （9）树胶封固。 3.染色结果 细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。如果胞质内含较多核糖 体(例如淋巴细胞)则亦呈蓝色。 （二）吉姆萨染色法 此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握， 效果常不如HE染色稳定。 1.吉姆萨(Giemsa)染液的配制 （1）取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油，置于60℃温箱，约3h后溶解。 （2）取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶可长久保存。需要注意的 是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色。 （3）将母液与0.1 mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆萨染 液对pH极敏感，偏酸时染色过红，偏碱时则过蓝。所以，工作液宜现用现配， 保存时间不超过48h以免被CO2酸化。 2.染色程序 （1）将标本用甲醇固定5～10min。 （2）入吉姆萨液染色10～15min。可用染色缸；或将染液滴覆于标本。 （3）蒸馏水清洗，空气干燥，二甲苯透明，树胶封固。 3.染色结果 细胞核呈蓝或蓝紫色，胞质呈色与HE染色相仿。 二、玻片处理方法 对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长 时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上 涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。 能促进细胞黏附的物质 主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。 1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。 2、用自来水冲洗5min。 3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。 4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。 5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。 6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交 细胞化学)。 三、培养物的常用固定方法 固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织 和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防 止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在 以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分 易于着色，适于观察、长期保存和分析。 1.固定组织、细胞的基本原则 尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方 法。 2.培养物的准备和固定前处理 各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培 养物都可作固定材料。对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集 细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培 养器皿中