第四次课原代细胞培养和红血球吸附要点分析.pptVIP

* 鸡胚原代细胞培养及流感病毒感染细胞的红细胞吸附 原代培养期： 　　也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。 细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛 原代培养细胞与供体组织在形态结构和功能活动上相似性大 细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同 细胞相互依存性强，细胞独立生存性差 原代培养细胞呈二倍体核型 传代期：　　原代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。 在全生命期中此期的持续时间最长 细胞增殖旺盛，大多能维持二倍体核型 为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养期或传代期早期冻存。反复传代就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化 衰退期： 一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期衰退期。 　　细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。 在传代末或衰退早期，由于多种因素的影响，部分细胞可能发生转化 转化的标志之一是细胞可能获得永生性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系 细胞获不死性后，核型大多变成异倍体 常规细胞实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管 原代培养的过程 取材 培养材料的制备 接种 加培养液 培养 准备工作： A. 解剖取材器具、用品的清洗、包装、灭菌 B. 工作台面、工作环境的消毒 C. 操作者本人的消毒：肥皂水刷手， 0.2%新洁尔灭浸泡前臂或者用酒精擦 拭消毒，穿工作衣，戴帽、口罩 D.对实验动物消毒 取材和培养材料的制备 A.切取合适大小的组织块或者器官，在平衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污，剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保持湿润； B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中，剪碎 C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ； D. 消化结束后，吸去含酶溶液，加入蛋白酶抑制剂或者含有血清的培养基，终止蛋白酶的活性； E. 用吸管吹打消化液，使单个细胞游离； F. 过滤离心收集单个细胞，以少量的培养液重新悬浮细胞； G. 用计数板计算细胞密度，调节细胞密度，接种。 取材注意事项 1. 取材要准确 2. 因“材”制宜进行处理 3. 保持湿润 4. 使用锋利的刀剪，防止细胞损伤 5. 动作快，耗时越少越好，必要时可以使用低温（4℃） 6. 取材应注意组织类型、分化程度、供体年龄等。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养 7. 原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。 1.培养液 按照细胞生长情况，选择最适合的培养液；摸索需要补加的成分及添加量；培养体系的酸碱度；适当换液 2.培养空间 培养液体与液体上方的空间的体积比为1:10为宜。液体的高度最好维持在2-5mm 培养注意事项 细胞原代培养用于病毒研究的优点 1）较低的隐性感染 2）没有免疫力 3）容易选择易感细胞 4）接种量大 5）培养条件易于控制 6）提高疫苗的产量和质量 7）加速病毒分离过程 *